메탄겐성 순수 문화 및 환경 샘플에서 폴리글루타메이트 꼬리 길이 분석을 위한 보조 자F420 추출

요약

순수한 배양으로부터 보조인 _F420 을 추출하는 방법은 순수한 배양 및 환경 샘플에서 _F420 꼬리 길이의 액체 크로마토그래피 분리 및 분석에 최적화되었다.

초록

공동 인자 _F420 많은 세균 및 고고학 택시의 기본 및 이차 대사에 수화물 캐리어로 중심 역할을한다. 공동 요소는 열역학적으로 어려운 반응을 용이하게 하는 메탄발생에 있는 그것의 역할로 가장 잘 알려져 있습니다. 폴리글루타메이트 꼬리는 서로 다른 유기체 들 사이의 길이가 다르기 때문에 길이 프로파일 분석은 다양한 서식지에서 다른 그룹과 경로를 구별하고 특성화하는 강력한 도구가 될 수 있습니다. 여기서, 프로토콜은 문화적 또는 분자 생물학적 접근법에 관계없이 고성능 액체 크로마토그래피 분석과 결합된 고체 상 추출을 적용하여 공동 인자 _F420 검출의 추출 및 최적화를 설명한다. 이 방법은 토양, 혐기성 슬러지 및 순수 배양에서 미생물 공동체로부터 공동 인자 _F420 의 발현에 대한 추가 정보를 얻기 위해 적용되었으며, 스파이크 실험에 의해 평가되었다. 이에 의해, 연구는 혐기성 소화기 슬러지 및 토양과 같은 환경 샘플뿐만 아니라 제어 메탄오제 순수 배양에서 수소 로피와 아세포 세포 세포 메탄원에 대한 다른 _F420 꼬리 길이 프로파일을 생성하는 데 성공했다.

서론

_F420은 광범위하지만 종종 무시된 공동 인자이며, 이는 Archaea와 ^Bacteria1,2의 1 차 및 이차 대사 과정에서 의무적인 두 전자 수화물 운반체역할을 합니다. _F420은 5-deazaflavin이며 구조적으로 플라빈스와 유사하며, 이에 따라 화학 적 및 생물학적 특성은 NAD ⁺ 또는 NADP ⁺와 더 비슷합니다. 이소알록사진 링의 위치 5에서 탄소를 가진 질소의 대체로 인해, 강력한 환원제이므로 -340 ^mV1,3의 낮은 표준 레독스 전위를 나타낸다. _F420은 5-deazaflavin 링과 2-인산 L-락테이트 링커(_F420-0)로 구성됩니다. n+1 글루타민산단모머를 함유한 올리고글루타메이트 꼬리를 분자(_F420-n+1)⁴에 부착할 수 있다.

오랜 시간 동안, 공동 요소 _F420은 전적으....

프로토콜

참고: 보조 자인 _F420 의 추출 및 분석은 형광 검출을 통한 이온 페어링 RP-HPLC(IP-RP-HPLC)를 통한 샘플 리시스, 고체 상 추출(SPE)을 통한 공동 재정화, 공동 요인 검출을 포함하는 3단계 공정이다. 시작하기 전에 표 1에 명시된 바와 같이 재료와 시약을 준비합니다.

1. 샘플 리시스

1. 적절한 튜브(예: 50mL 원문 튜브)에 최대 5g의 샘플을 추가합니다.
2. 샘플에 용해 버퍼(2배 재고 용액, 표 1)의 5mL를 추가합니다.
3. 증류수로 10mL의 최종 부피를 가져와 최종 농도0.5g·^mL-1에 도달하십시오.
4. 20 초 동안 희석 된 샘플을 소용돌이.
5. 121 °C에서 30 분 동안 오토 클레이브.
6. 삼림 토양과 같은 건조 한 샘플의 경우, 희석 된 샘플을 autoclaving 후 증류수와 20 mL의 최종 부피를 가져.
   주의: 오토클레이브 중 온도 상승으로 인해 튜브가 파열될 수 있습니다.

2. 고체위상 추출(SPE)을 통한 공동요소 F ₄₂₀....

결과

메탄노사피나 열애와 메탄오쿨레우스 열애의 순수한 배양, 열성성 메탄생성성 고고학모두 이전에 설명된 바와 같이 적합한 배지에서 재배되었다^29,30. 메탄노사피나 열애의 경우 메탄올이 에너지원으로 사용되었지만, 메탄모쿨레우스 열애는 _H2/_CO2에서 재배되었다. 성장은 현미경 평가에 의해 검사되었으며, 활동은 이전에 설명된 바와 같이 가스 크로마토그래피에 의한 메탄(_CH4)의 측정을 통해 조사되었다³¹. 순수한 배양은 제시된 프로토콜에 따라 보조 인자 _F420의 추출에 사용되었다. 또한, 중구 바이오가스 원자로 슬러지(폐수 처리장, 지얼, 오스트리아)의 샘플을 포함한 환경 샘플을 포함한 환경 샘플은 슬러지 파라미터에 대한 자세한 내.......

토론

메탄원성 순수 배양으로부터의 공동인자 _F420의 평가를 위해, 관련 미생물의 성장 및 활성(형광 현미경 검사법)을 시각화하기 위해 현미경 평가를 수행할 수 있다(도 1). 자연 환경에서 파생되는 시료의 경우, _F420을 감지하거나 정량화하기 위해 현미경을 사용하는 것은 다른 형광 미생물, 유기 및 무기 입자와의 간섭으로 인해 제한됩니다. 이러한 맥락에서^{, 이전에 설명}된 바와 같이 HPLC를 이용한 _F420 및 후속 형광 분석의 추출은 보조인 _F420의 전반적인 농도뿐만 아니라 다과상 꼬리 길이 분포에 대한 정보를 제공할 수 있다.

보조자 _F420의 추출을 위해, 압력 온도 처리는 매우 효과적인 것으로 나타났다 (도 2) 이전 연구 결과.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
클레이브
생체 적합성 HPLC 시스템, 그래디언트 모듈, 오븐 및 형광 검출기가 장착된	Shimadzu		HPLC 시스템
50mL용 원심분리기 및 로터 " 매" 튜브 (11.000 rcf) 및 적절한 튜브
HPLC 컬럼 : 쌍둥이 자리 NX C18, 5 μ m, 150 x 3 mm	Phenomenex		HPLC 란
PTFE 여과기 (숨구멍 크기 0.22 µ m) 사전 HPLC 분석
SPE용 수지: Strata-X-AW 33 μ m as weak anion mixed-mode polymeric sorbent	Phenomenex		weak anion mixed-mode polymeric sorbent
SPE 및 적절한 수집 튜브			SPE 장비
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