Definindo funções genéticas em Tumorigênese por Ex vivo Ablaation of Floxed Alleles in Maligna Periférico Nerve Hemato Tumor Cells

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para a realização de nocautes genéticos que são embrionários letais in vivo em tumores derivados de camundongos geneticamente modificados e, em seguida, avaliando o efeito que o nocaute tem sobre o crescimento do tumor, proliferação, sobrevivência, migração, invasão e a transcrição in vitro e in vivo.

Abstract

O desenvolvimento de novas drogas que visam precisamente proteínas-chave em cânceres humanos está alterando fundamentalmente a terapêutica do câncer. No entanto, antes que essas drogas possam ser usadas, suas proteínas-alvo devem ser validadas como alvos terapêuticos em tipos específicos de câncer. Essa validação é frequentemente realizada derrubando o gene que codifica o alvo terapêutico candidato em um modelo de câncer de camundongo geneticamente modificado (GEM) e determinando que efeito isso tem no crescimento do tumor. Infelizmente, questões técnicas como a letalidade embrionária em nocautes convencionais e o mosaico em nocautes condicionalmente muitas vezes limitam essa abordagem. Para superar essas limitações, desenvolveu-se uma abordagem para ablação de um gene letal embrionário floxed de interesse em culturas de curto prazo de tumores malignos de bainha periférica (MPNSTs) gerados em um modelo GEM.

Este artigo descreve como estabelecer um modelo de camundongo com o genótipo apropriado, derivar culturas tumorais de curto prazo desses animais e, em seguida, ablate o gene letal embrionário floxed usando um vetor adenoviral que expressa Cre recombinase e proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP). Purificação de células transduzidas com adenovírus usando classificação celular ativada por fluorescência (FACS) e a quantificação dos efeitos que a ablação genética exerce sobre a proliferação celular, viabilidade, o crescimento de andoenxertos transcritos e ortotópicos é então detalhado. Essas metodologias fornecem uma abordagem eficaz e generalizável para identificar e validar alvos terapêuticos in vitro e in vivo. Essas abordagens também fornecem uma fonte renovável de células derivadas de tumores de baixa passagem com artefatos de crescimento in vitro reduzidos. Isso permite que o papel biológico do gene-alvo seja estudado em diversos processos biológicos, como migração, invasão, metástase e comunicação intercelular mediada pelo secretome.

Introduction

Antes das últimas duas décadas, o tratamento dos cânceres humanos dependia fortemente de radioterapia e agentes quimioterápicos que visavam rapidamente proliferar populações celulares, danificando o DNA ou inibindo a síntese de DNA. Embora essas abordagens tenham inibido o crescimento de células cancerosas, elas também tiveram efeitos colaterais deletérios em tipos celulares normais que proliferam rapidamente, como células epiteliais intestinais e células folículos capilares. Mais recentemente, a terapia oncológica começou a utilizar agentes quimioterápicos que visam precisamente proteínas dentro de vias de sinalização que são criticamente importantes para o crescimento da neoplasia de um paciente individual. Essa abordagem, comumente referida como “Medicina de Precisão”, levou ao desenvolvimento de um repertório cada vez maior de anticorpos monoclonais e pequenos inibidores moleculares. Esses agentes efetivamente inibem a proliferação e a sobrevivência das células tumorais, evitando os efeitos colaterais deletérios em tipos celulares normais vistos com agentes quimioterápicos convencionais e radioterapia. Anticorpos monoclonais usados para o tratamento de cânceres humanos mais comumente visam moléculas de superfície celular, como receptores de fator de crescimento¹ (por exemplo, a grande família de quinases receptoras de membrana) e moduladores de resposta imune² (por exemplo, proteína de morte celular programada 1, liga-morte programada 1). Pequenos inibidores moleculares podem inibir proteínas da superfície celular ou proteínas de sinalização que estão localizadas intracelularmente³. No entanto, para efetivamente empregar esses novos agentes terapêuticos, deve-se estabelecer que um determinado câncer depende da molécula que está sendo alvo de um agente terapêutico candidato.

Embora esses novos agentes terapêuticos tenham efeitos mais focalizadas, muitos deles ainda inibem a ação de mais de uma proteína. Além disso, vários agentes com eficácia e especificidade variadas estão frequentemente disponíveis para atingir uma proteína específica. Consequentemente, durante investigações pré-clínicas, é prudente usar abordagens adicionais, como a ablação genética para validar uma proteína candidata como alvo terapêutico. Uma abordagem especialmente útil para validar uma proteína como alvo terapêutico é ablate o gene codificando a proteína candidata em um modelo animal geneticamente modificado que desenvolve o tipo específico de câncer de interesse. Essa abordagem pode ser relativamente simples se ratos com uma mutação nula (ou uma mutação natural, uma mutação nula geneticamente modificada [um “nocaute”], ou uma mutação nula introduzida por uma armadilha genética) estiverem disponíveis, e os camundongos forem viáveis até a idade adulta. Infelizmente, camundongos com uma mutação nula que atendem a esses critérios muitas vezes não estão disponíveis, tipicamente porque a mutação nula resulta em morte embrionária ou nos primeiros dias de vida pós-natal. Nesta circunstância, camundongos propensos a desenvolver o tipo de interesse tumoral podem, em vez disso, ser cruzados para camundongos nos quais segmentos-chave do gene de interesse são flanqueados por locais loxP (“floxed”), o que permite que o gene seja ablado introduzindo um transgene expressando Cre recombinase nas células tumorais (um nocaute condicional). Essa abordagem oferece várias vantagens. Primeiro, se um driver Cre estiver disponível que seja expresso no tumor, mas não no tipo celular que levou à morte em nocautes convencionais, essa abordagem pode potencialmente validar o alvo terapêutico do candidato. Em segundo lugar, a ablação do gene que codifica a proteína candidata em células tumorais, mas não em outros elementos intratumorais, como fibroblastos ou células imunes associadas ao tumor, permite ao pesquisador distinguir entre efeitos célula-autônomos e não-células-autônomas do alvo terapêutico. Finalmente, um driver Cre indutível de tamoxifen (CreER^T2) permite que o investigador exclua o gene de interesse em diferentes estágios no desenvolvimento do tumor e defina a janela em que o agente terapêutico candidato é mais provável que seja eficaz.

Infelizmente, há também questões técnicas que podem limitar o uso de nocautes condicionais em tumores surgidos em modelos GEM. Por exemplo, um driver Cre que é expresso em células tumorais e evita a exclusão genética em células normais essenciais para a vida pode não estar disponível. Outra questão, que pode ser subestimada, é que os drivers Cre e CreER^T2 muitas vezes variavelmente ablatam alelos floxed em camundongos, resultando em mosaico para a mutação nula em um câncer GEM. Quando isso ocorrer, as células tumorais nas quais o gene alvo não foi ablado continuarão a proliferar rapidamente, superculcendo as células tumorais com alelos ablados. O mosaicismo nas linhas de driver cre pode ocorrer devido à expressão cre não onipresente na linhagem direcionada e pela recombinação fracassada em células individuais independentes da expressão Cre⁴. Este é um fenômeno conhecido dos drivers Cre que é dependente do tipo celular e deve ser considerado durante o desenho experimental e interpretação de dados. O mosaico pode mascarar o efeito do nocaute e levar um investigador a concluir erroneamente que o gene de interesse não é essencial para a proliferação e/ou sobrevivência das células tumorais e, portanto, não é um alvo terapêutico válido.

Vários desses problemas foram encontrados em um estudo anterior que tentou determinar se o receptor tyrosine quinase erbB4 era um alvo terapêutico potencial nas células MPNST⁵. Nesses estudos, foram utilizados camundongos que expressam um transgene codificando o fator de crescimento gliano isoforme-β3 (GGFβ3) sob o controle do promotor zero de proteína de mielina específico da célula Schwann (camundongos P 0-GGFβ3). Os camundongos P 0-GGFβ3 desenvolvem neurofibromas plexiformes múltiplos que avançam para se tornarem MPNSTs através de um processo que recapitula os processos de patogênese neurofibroma e progressão neurofibroma-MPNST plexiforme observada em pacientes com a síndrome de susceptibilidade do tumor autossômico dominante neurofibromatose tipo 1 (NF1)⁶. Quando atravessado para camundongos com uma mutação nula Trp53, o P 0-GGFβ3 resultante; Os camundongos Trp53^+/- desenvolvem MPNSTs de novo como é visto no cis-Nf1^+/-; Trp53^+/- ratos.

Esses MPNSTs recapitulam a progressão das lesões grau II da Organização Mundial da Saúde (OMS) para a OMS, observadas em humanos⁷. Em_camundongos P 0-GGFβ3, os MPNSTs surgem dentro de neurofibromas plexiformes pré-existentes no nervo trigêmeo (58%) e raízes do nervo dorsal espinhal (68%)⁷; os MPNSTs surgidos em P 0-GGFβ3; Os ratos Trp53^+/- têm uma distribuição altamente semelhante. Em humanos, os MPNSTs mais comumente surgem no nervo ciático seguido pelo plexo braquial, raízes nervosas espinhais, vagus, femoral, mediana, plexo sacral, obturador popliteal e nervos tibiais e ulnar posteriores⁸. Esta distribuição de tumores nesses modelos GEM é um pouco diferente do que é visto em humanos. No entanto, os MPNSTs que surgem em P 0-GGFβ3 e P_0-GGFβ3; Os camundongos trp53^+/- são histologicamente idênticos aos MPNSTs humanos, carregam muitas das mesmas mutações vistas nos MPNSTs humanos e recapitulam o processo de progressão neurofibroma-MPNST observado em pacientes NF1. A geração de P 0-GGFβ3 ou P_0-GGFβ3; Trp53^+/- camundongos que eram Erbb4^-/- não eram viáveis, pois camundongos com dois alelos nulos Erbb4 morrem no útero no dia embrionário 10,5 secundários a defeitos cardíacos⁹. Porque resgatar a expressão Erbb4 no coração introduzindo um transgene Erbb4 específico para o coração (cadeia pesada de α-miosina (MHC)-Erbb4) resulta em erbb4^-/- camundongos¹⁰ viáveis, a geração de ratos com um complicado P 0-GGFβ3; Trp53^+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4^-/- genótipo foi tentado.

No entanto, os acasalamentos não produziram camundongos nas razões mendelianas esperadas, indicando que o genótipo desejado era deletério. Portanto, a geração de P 0-GGFβ3; Trp53^+/- ratos com alelos Erbb4 floxed¹¹ e um driver CreER^T2 foi tentado para permitir a exclusão de Erbb4 nos MPNSTs surgidos nestes ratos. Nesses animais, numerosas células tumorais com alelos Erbb4 intactos ainda estavam presentes (mosaico). O mosaico observado pode resultar da entrega ineficiente de tamoxifen, que resultou em diferenças na eficiência de recombinação dentro do tecido. A possibilidade de mecanismos compensatórios espontâneos poderia contribuir ainda mais para o mosaico na recombinação mediada pelo tamoxifen, ignorando a exigência de expressão de Erbb4. É viável que a perda de Trp53 torne as células tumorais suscetíveis a mutações espontâneas adicionais “permissivas” que possam confundir a interpretação dos dados. Como parecia provável que as células MPNST intactas Erbb4 mascarassem as consequências de ablar Erbb4 em outras células tumorais, essa abordagem foi abandonada.

Esses obstáculos levaram ao desenvolvimento de uma metodologia para ablação de células MPNST de passagem muito precoce usando um adenovírus expressando Cre recombinase e eGFP. Essas células podem ser separadas de células não infectadas usando FACS, o que reduz significativamente o mosaico para o gene Erbb4 ablado. Abaixo, são descritos os métodos utilizados para isso, juntamente com os métodos utilizados para avaliar os efeitos da ablação genética in vitro e in vivo. O protocolo a seguir é um exemplo de como produzir camundongos portadores de tumores que produzem tumores portadores de alelos floxados de genes letais embrionários de interesse para ex vivo excisão antes da avaliação de crescimento do tumor in vivo a allograft. Isso inclui uma descrição das abordagens usadas para analisar o efeito que a ablação de Erbb4 exerce sobre a proliferação de células tumorais, sobrevivência e expressão genética in vitro e proliferação, sobrevivência e angiogênese em alóxeris ortotópicos.

Protocol

Antes de realizar qualquer procedimento com camundongos, todos os procedimentos devem ser revistos e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais. O protocolo descrito neste manuscrito foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica da Carolina do Sul. Este protocolo foi realizado por pessoal devidamente treinado seguindo as diretrizes institucionais de cuidados com animais do MUSC. 1. Geração de camundongos que desenvolvem MPNST…

Representative Results

A Figura 4 ilustra um resultado típico obtido ao transdutor P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Células MPNST erbb4fl/fl com o adenovírus Ad5CMV-eGFP ou adenovírus Ad5CMV-Cre/eGFP (Figura 4A). As culturas são vistas com microscopia de fluorescência para identificar células expressas pelo eGFP e por microscopia de contraste de fase para determinar o número total de células presentes no mesmo campo em 10x (superior) e …

Discussion

Os métodos detalhados aqui apresentados foram desenvolvidos utilizando-se um modelo GEM de MPNSTs. No entanto, se o tecido tumoral de interesse pode ser dispersado em células individuais, essas metodologias são facilmente adaptáveis para vários tipos de tumores surgidos em GEMs. É importante garantir que o alelo floxed não resulte em i) diminuição da sobrevida que pode dificultar a obtenção de camundongos suficientes para a triagem de tumores, ou ii) aumento da latência tumoral que pode dificultar a obtençã…

Materials

Ad5CMV-eGFP	Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa	VVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFP	Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa	VVC-U of Iowa-1174
alexa 568 secondary antibody	Thermo/Fisher	GaR A11036
Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics	Bioconductor	http://www.bioconductor.org	alternative statistical analysis tool used for step 4.4
CD31	Abcam	ab28364
Celigo Image Cytometer	Nexcelom Bioscience	N/A
Cell Stripper	Corning	25-056-Cl	mixture of chelators
DAB staining kit	Vector Labs	MP-7800
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)	DAVID	https://david.ncifcrf.gov	functional enrichment analysis software used for step 4.5
DMEM	Corning	15-013-Cl
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)	Thermo/Fisher	EP0701 and K1072
erbB4 antibodies	Santa Cruz	sc-284
erbB4 antibodies	Abcam	ab35374
erbB4 antibodies	Millipore	HFR1: 05-1133
FACS Sorter	BD Biosciences	Aria II
Forskolin	Sigma	F6886
GenomeSpace Tools and Data Sources	GenomeSpace	https://genomespace.org/support/tools/	general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5
Glutamine	Corning	25-005-Cl
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool	Gorilla	N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il	functional enrichment analysis software used for step 4.5
GSEA Gene Set Enrichment Analysis	Broad Institute	N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp	functional enrichment analysis software used for step 4.5
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice	Envigo (Previously Harlan Labs)	69
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)	Illumina	Hi Seq 2500	DNA sequencer used for step 4.2
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis	DNAStar LaserGene software	N/A	software statistical and normalization analysis used for step 4.4
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly	software alignment used for step 4.3	N/A	software alignment used for step 4.3
Matrigel, low growth factor basement membrane matrix	Corning	354230
NRG1-beta	In house	Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF).
Nuclear Stain Hoeschst 33342	Thermo	62249
Panther Gene Ontology Classification System	Panther	http://pantherdb.org	functional enrichment analysis software used for step 4.5
Partek (BWA aligner and analyzer)	Partek, Ver 7	N/A	software alignment and statistical/normalization used for step 4.3
Pen/Strep	Corning	30-002-Cl
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA ACCCAG-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product.
Propidium Iodine	Fisher	51-351-0
Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays	R&D Systems	ARY003B
Real time glo	Promega	G9712	bioluminescent cell viability assay
ToppGene Suite	ToppGene	https://toppgene.cchmc.org	functional enrichment analysis software used for step 4.5
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)	Invitrogen	15596026
Tyramide Signal Amplification Kit	Perkin Elmer	NEL721001EA