Ontwikkeling van een laterale flow immunochromatografische strip voor snelle en kwantitatieve detectie van kleine molecuulverbindingen
Abstract
Membraangebaseerde laterale flow immunochromatografische strips (ICS’en) zijn nuttige hulpmiddelen voor goedkope zelfdiagnose en zijn efficiënt toegepast op toxine-, fysiologische index- en klinische biomarkerdetectie. In dit protocol geven we een gedetailleerde beschrijving van de stappen om een snelle, gevoelige en kwantitatieve laterale-flow immunoassay te ontwikkelen (met AuNPs als marker en mAbs als probe). De procedure beschrijft de bereiding en karakterisering van colloïdaal goud, synthese van het AuNP-mAb-conjugaat, assemblage van de immunochromatografische strip en methodologisch onderzoek van de test. De resultaten toonden aan dat de laatste strips verder kunnen worden gebruikt voor de snelle en gemakkelijke zelfdiagnose van een klein molecuul, wat een alternatief hulpmiddel kan bieden bij de snelle en nauwkeurige analyse van fysiologische en biologische indices.
Introduction
Membraangebaseerde laterale flow immunochromatografische strips (ICS’en) zijn nuttige hulpmiddelen voor goedkope en snelle detectie. Het nitrocellulosemembraan als drager en colloïdaal goud als markers van immuunchromatografie snelle diagnostische reagentia zijn de meest gebruikte POCT-methode (point of care testing) en de testomvang van het project is breder. Van hun oorspronkelijke toepassing bij monitoring tijdens de zwangerschap, is hun gebruik uitgebreid tot het controleren van de bloedstollingstoestand1,2,myocardiale verwonding3,diergeneeskunde4,residuen van bestrijdingsmiddelen5,infectieziekten6 en medicijnconcentraties. Meer soorten monsters kunnen worden beoordeeld, waaronder urine, speeksel, volbloed, serum en andere lichaamsvloeistoffen7,8,9.
In de afgelopen jaren zijn tal van nieuwe assays ontwikkeld voor het detecteren van biomarkers bij de diagnose van aandoeningen, waaronder HPLC, UPLC, LC-MS en ELISA, die gevoelig en nauwkeurig, geloofwaardig en specifiek zijn. Deze methoden vereisen echter geavanceerde instrumentatie, complexe voorbewerking en tijdrovende behandelingen9. Daarom is het ontwikkelen van een snellere en handigere point-of-care diagnostische strategie voor de zelf- en real-time detectie van medicinale actieve verbindingen dringend10,11.
De populariteit van ICS’en, vooral voor veel voorkomende tests, wordt gedreven door hun gebruiksgemak, omdat ze geen professionals of uitgebreide instrumentale opstellingen vereisen12. Met andere woorden, mensen die geen speciale training hebben, kunnen strips of zelftests bedienen13. De resultaten van de test kunnen in 5 minuten worden verkregen, wat betekent dat deze kan worden gebruikt voor inspecties ter plaatse14. Bovendien kunnen volgens onze berekeningen de kosten van strips lager zijn dan 1 RMB15, wat betekent dat de tests goedkoop zijn om16te promoten . Vandaar dat de ICS een relatief nauwkeurig, eenvoudig en goedkoop wegwerpapparaat is. ICS’en op basis van colloïdaal goud17,18 worden ook toegepast bij snelle COVID-19-detectie.
Het principe van ICS is onder te verdelen in sandwich ICS en competitive ICS. Figuur 1A is een schematisch diagram van de sandwich ICS, die voornamelijk wordt gebruikt voor het detecteren van macromoleculaire stoffen zoals eiwitten, waaronder tumormarkers, ontstekingsfactoren en humaan choriongonadotrofine (HCG, antigeen in de vroege zwangerschap). Bij deze methode worden gepaarde antilichamen gericht op verschillende epitopen van het antigeen gebruikt en wordt het vanvangantilichaam als testlijn op het NC-membraan gedroogd. Gelabeld antilichaam wordt gedroogd op het geconjugeerde pad en secundair antilichaam wordt gebruikt als controlelijn.
Figuur 1B is een schematisch diagram van concurrerende ICS, dat voornamelijk wordt gebruikt om stoffen met kleine moleculen te detecteren (MWCO < 2000 Da). Het coatingantigeen wordt als testlijn op het NC-membraan gefixeerd en het gelabelde antilichaam wordt gedroogd op het geconjugeerde pad. Tijdens de detectie stromen het monster en het gelabelde antilichaam onder capillaire werking door de detectielijn en bindt het gecoate antigeen concurrerend vrij antigeen in het monster en ontwikkelt een rode kleur op de detectielijn.
Onlangs beschreven we de procedure van monoklonale antilichaamgeneratie tegen natuurlijke producten19. In dit werk ontwikkelden we een nieuwe laterale flow immunoassay op basis van de voorbereide anti-SSD mA20 voor snelle, on-site detectie. De resultaten geven aan dat de immunochromatografietest een onmisbaar en handig hulpmiddel is voor het detecteren van van natuurlijke producten afgeleide verbindingen.
Figuur 1 Schematisch diagram van de immunochromatografietest (A) Sandwich immunochromatografische teststrips. B)Indirect concurrerende immuunchromatografische teststrips. Dit cijfer is gewijzigd van Zhang et al.,201821. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit werk presenteren we een protocol voor de bereiding van mAbs tegen van natuurlijke producten afgeleide kleine moleculen. De essentiële stappen en de zaken die aandacht nodig hebben in de procedure zijn geschetst en we hebben het nut van dit protocol aangetoond met behulp van het kleine molecuul SSD als voorbeeld. Voorbeeldspectra, TEM-beelden, kwantitatieve resultaten en methodologisch onderzoek worden weergegeven in representatieve gegevens. Daarom hebben we aangetoond dat de colloïdaal goudproductie, AuNP-mAb-c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Speciale Fondsen voor Fundamenteel Onderzoek fondsen van instellingen voor hoger onderwijs verbonden aan centrale afdelingen. We waarderen de steun van classical prescription basic research team van de Beijing University of Chinese Medicine.
Materials
| Chloroauric acid solution (HAuCl4) | Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory | JY-SJ102 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| Filter paper | Sinopharm | H5072 | |
| Glass fibre membranes | Jieyi | XQ-Y6 | |
| goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| Nitrocellulose membranes | Millipore | millipore 180 | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG20000 | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Pipette 10mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25mL | FALCON | 357525 | |
| semi-rigid PVC sheets | Jieyi | JY-C104 | |
| Sodium citrate | Beijing Chemical Works | C1034 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Tris-HCl | Solarbio | 77-86-1 | |
| TWEEN 20 | Solarbio | 9005-64-5 |
References
- Huang, X., et al. Membrane-based lateral flow immunochromatographic strip with nanoparticles as reporters for detection: A review. Biosensors and Bioelectronics. 75, 166-180 (2016).
- Chang, H. -. F., Wang, J. -. Q., Wang, B., Deng, A. -. P. An immune chromatographic assay for rapid and simultaneous detection of levonorgestrel and methylprednisolone in water samples. Chinese Chemical Letters. 24 (10), 937-940 (2013).
- Lai, J. J., Stayton, P. S. Improving lateral-flow immunoassay (LFIA) diagnostics via biomarker enrichment for mHealth. Methods in Molecular Biology. 1256, 71-84 (2015).
- Zhang, M. Z., et al. Development of a colloidal gold-based lateral-flow immunoassay for the rapid simultaneous detection of clenbuterol and ractopamine in swine urine. Analytical & Bioanalytical Chemistry. 395 (8), 2591-2599 (2009).
- Kranthi, K. R., et al. Development of a colloidal-gold based lateral-flow immunoassay kit for ‘quality-control’ assessment of pyrethroid and endosulfan formulations in a novel single strip format. Crop Protection. 28 (5), 428-434 (2009).
- Qian, K., et al. Development and evaluation of an immunochromatographic strip for rapid detection of capsid protein antigen p27 of avian leukosis virus. Journal of Virological Methods. (221), 115-118 (2015).
- Guo, H., et al. Lateral flow immunoassay devices for testing saliva and other liquid samples and methods of use of same. US Patent. , (2003).
- Miočević, O., et al. Quantitative Lateral Flow Assays for Salivary Biomarker Assessment: A Review. Frontiers in Public Health. 5, 1-13 (2017).
- Lisa, M., et al. Gold nanoparticles based dipstick immunoassay for the rapid detection of dichlorodiphenyltrichloroethane: an organochlorine pesticide. Biosensors and Bioelectronics. 25 (1), 224-227 (2009).
- Zhang, Z., et al. Monoclonal Antibody-Europium Conjugate-Based Lateral Flow Time-Resolved Fluoroimmunoassay for Quantitative Determination of T-2 Toxin in Cereals and Feed. Analytical Methods. 7 (6), 2822-2829 (2015).
- Shen, H., et al. Facile synthesis of high-quality CuInZnxS2+x core/shell nanocrystals and their application for detection of C-reactive protein. Journal of Materials Chemistry. 22 (35), 18623-18630 (2012).
- Xiang, T., et al. A novel double antibody sandwich-lateral flow immunoassay for the rapid and simple detection of hepatitis C virus. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1041-1047 (2012).
- Yang, Q., et al. Quantum dot-based immunochromatography test strip for rapid, quantitative and sensitive detection of alpha fetoprotein. Biosensors & Bioelectronics. 30 (1), 145 (2011).
- Song, L. W., et al. Rapid fluorescent lateral-flow immunoassay for hepatitis B virus genotyping. Analytical Chemistry. 87, 5173-5180 (2015).
- Zhang, Y., et al. Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).
- Qu, H., et al. Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of GsRerarin. Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
- Li, Z., et al. Development and Clinical Application of a Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis. Journal of Medical Virology. 92 (9), (2020).
- Xiaomei, L., Jing, W., Ya, Z. The clinical application value analysis of the 2019-coronary virus disease was analyzed by the whole blood Sars-COV 2 specific antibody detection. Natural Science Edition. 42, (2020).
- Zhang, Y., et al. Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products. Journal of Visualized Experiments. , e57116 (2019).
- Sai, J., et al. Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Immunoaffinity Column Chromatography for Saikosaponin d Using an Anti-Saikosaponin d Monoclonal Antibody. Planta Medica. 82, 432-439 (2016).
- Yue, Z., et al. A Highly Sensitive Immunochromatographic Strip Test for Rapid and Quantitative Detection of Saikosaponin d. Molecules. 23 (2), 338 (2018).
- Qu, H., et al. Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of Puerarin. Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
- Zhang, Y., et al. Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).
