Desarrollo de una tira inmunocromatográfica de flujo lateral para la detección rápida y cuantitativa de compuestos de moléculas pequeñas
Abstract
Las tiras inmunocromatográficas de flujo lateral (CSI) basadas en membranas son herramientas útiles para el autodiagnóstico de bajo costo y se han aplicado de manera eficiente a la detección de toxinas, índices fisiológicos y biomarcadores clínicos. En este protocolo, proporcionamos una descripción detallada de los pasos para desarrollar un inmunoensayo de flujo lateral rápido, sensible y cuantitativo (utilizando AuNPs como marcador y mAbs como sonda). El procedimiento describe la preparación y caracterización del oro coloidal, la síntesis del conjugado AuNP-mAb, el ensamblaje de la tira inmunocromatográfica y la investigación metodológica del ensayo. Los resultados mostraron que las tiras finales se pueden utilizar aún más para el autodiagnóstico rápido y conveniente de una molécula pequeña, lo que puede proporcionar una herramienta alternativa en el análisis rápido y preciso de los índices fisiológicos y biológicos.
Introduction
Las tiras inmunocromatográficas de flujo lateral (CSI) basadas en membranas son herramientas útiles para la detección rápida y de bajo costo. La membrana de nitrocelulosa como portadora y el oro coloidal como marcadores de los reactivos de diagnóstico rápido de cromatografía inmune son el método POCT (prueba de punto de atención) más utilizado, y el alcance de la prueba del proyecto es más amplio. Desde su aplicación original en el monitoreo durante el embarazo, su uso se ha extendido para monitorear el estado de coagulación sanguínea1,2, lesiónmiocárdica3,medicina veterinaria4,residuos de pesticidas5,enfermedades infecciosas6 y concentraciones de medicamentos. Se pueden evaluar más tipos de muestras, incluyendo orina, saliva, sangre total, suero y otros fluidos corporales7,8,9.
En los últimos años, se han desarrollado numerosos ensayos novedosos para detectar biomarcadores en el diagnóstico de trastornos, incluidos HPLC, UPLC, LC-MS y ELISA, que son sensibles y precisos, creíbles y específicos. Sin embargo, estos métodos requieren instrumentación sofisticada, preprocesamiento complejo y tratamientos que consumen mucho tiempo9. Por lo tanto, el desarrollo de una estrategia de diagnóstico en el punto de atención más rápida y conveniente para la detección automática y en tiempo real de compuestos activos medicinales es urgente10,11.
La popularidad de los CSI, especialmente para pruebas comunes, está impulsada por su facilidad de uso, ya que no requieren profesionales ni configuraciones instrumentales elaboradas12. En otras palabras, las personas que no tienen entrenamiento especial pueden operar tiras o autopruebas13. Los resultados de la prueba se pueden obtener en 5 minutos, lo que significa que se puede utilizar para inspecciones in situ14. Además, según nuestros cálculos, el costo de las tiras podría ser inferior a 1 RMB15,lo que significa que las pruebas son baratas para promover16. Por lo tanto, el ICS es un dispositivo desechable relativamente preciso, simple y económico. Los CSI basados en oro coloidal17,18 también se aplican en la detección rápida de COVID-19.
El principio de ICS se puede dividir en ICS sándwich e ICS competitivo. La Figura 1A es un diagrama esquemático del CSI sándwich, que se utiliza principalmente para detectar sustancias macromoleculares como proteínas, incluidos marcadores tumorales, factores inflamatorios y gonadotropina coriónica humana (HCG, antígeno del embarazo temprano). En este método, se utilizan anticuerpos pareados dirigidos a diferentes epítopos del antígeno, y el anticuerpo de captura se seca en la membrana NC como una línea de prueba. El anticuerpo marcado se seca en la almohadilla conjugada, y el anticuerpo secundario se utiliza como línea de control.
La Figura 1B es un diagrama esquemático de ICS competitivo, que se utiliza principalmente para detectar sustancias de moléculas pequeñas (MWCO < 2000 Da). El antígeno de recubrimiento se fija en la membrana NC como una línea de prueba, y el anticuerpo marcado se seca en la almohadilla conjugada. Durante la detección, la muestra y el anticuerpo marcado fluyen a través de la línea de detección bajo acción capilar, y el antígeno recubierto se une competitivamente al antígeno libre en la muestra y desarrolla un color rojo en la línea de detección.
Recientemente, describimos el procedimiento de generación de anticuerpos monoclonales contra productosnaturales 19. En este trabajo, desarrollamos un nuevo inmunoensayo de flujo lateral basado en el anti-SSD mA20 preparado para una detección rápida in situ. Los resultados indican que el ensayo de inmunocromatografía es una herramienta indispensable y conveniente para detectar compuestos derivados de productos naturales.
Figura 1 Diagrama esquemático del ensayo de inmunocromatografía (A) Tiras reactivas inmunocromatográficas sándwich. (B) Tiras reactivas cromatográficas inmunes competitivas indirectas. Esta cifra ha sido modificada de Zhang et al.,201821. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo, presentamos un protocolo para la preparación de mAbs contra moléculas pequeñas derivadas de productos naturales. Se han esbozado los pasos esenciales y los asuntos que necesitan atención en el procedimiento, y hemos demostrado la utilidad de este protocolo utilizando la molécula pequeña SSD como ejemplo. Los espectros de ejemplo, las imágenes TEM, los resultados cuantitativos y las investigaciones metodológicas se muestran en datos representativos. Por lo tanto, hemos demostrado que la producció…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los Fondos Especiales para Fondos de Investigación Fundamental de instituciones de educación superior afiliadas a departamentos centrales. Agradecemos el apoyo del Equipo de Investigación Básica de Prescripción Clásica de la Universidad de Medicina China de Beijing.
Materials
| Chloroauric acid solution (HAuCl4) | Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory | JY-SJ102 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| Filter paper | Sinopharm | H5072 | |
| Glass fibre membranes | Jieyi | XQ-Y6 | |
| goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| Nitrocellulose membranes | Millipore | millipore 180 | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG20000 | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Pipette 10mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25mL | FALCON | 357525 | |
| semi-rigid PVC sheets | Jieyi | JY-C104 | |
| Sodium citrate | Beijing Chemical Works | C1034 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Tris-HCl | Solarbio | 77-86-1 | |
| TWEEN 20 | Solarbio | 9005-64-5 |
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