Utveckling av en immunokromatografisk remsa för lateralt flöde för snabb och kvantitativ detektion av små molekylföreningar
Abstract
Membranbaserade laterala flöde immunokromatographic remsor (ICSs) är användbara verktyg för lågkostnads självdiagnos och har effektivt tillämpats på toxin, fysiologiska index och kliniska biomarkör detektion. I detta protokoll ger vi en detaljerad beskrivning av stegen för att utveckla en snabb, känslig och kvantitativ lateral-flow immunoassay (med AuNPs som markör och mAbs som sond). Förfarandet beskriver beredning och karakterisering av kolloidalt guld, syntes av AuNP-mAb konjugat, montering av immunokromatografiska remsan och metodologiska undersökning av analysen. Resultaten visade att de slutliga remsorna kan användas ytterligare för snabb och bekväm självdiagnos av en liten molekyl, vilket kan ge ett alternativt verktyg i snabb och exakt analys av fysiologiska och biologiska index.
Introduction
Membranbaserade laterala flöde immunokromatografiska remsor (ICS) är användbara verktyg för låg kostnad och snabb detektion. Nitrocellulosamembranet som bärare och kolloidalt guld som markörer för immunkromatografi snabba diagnostiska reagenser är den vanligaste POCT-metoden (point of care testing) och projektets testomfång är bredare. Från deras ursprungliga tillämpning i övervakning under graviditeten har deras användning utvidgats för att övervaka blodkoagulationstillstånd1,2, skador på myokardskador3, veterinärmedicin 4 ,bekämpningsmedelsrester5, infektionssjukdomar6 och läkemedelskoncentrationer. Fler typer av prover kan bedömas, inklusive urin, saliv, helblod, serum och andrakroppsvätskor 7,8,9.
Under de senaste åren har många nya analyser utvecklats för att upptäcka biomarkörer vid diagnos av sjukdomar, inklusive HPLC, UPLC, LC-MS och ELISA, som är känsliga och exakta, trovärdiga och specifika. Dessa metoder kräver dock sofistikerad instrumentering, komplex förbearbetning och tidskrävande behandlingar9. Därför är det brådskande10,11.
Populariteten hos ICSs, särskilt för vanliga tester, drivs av deras användarvänlighet, eftersom de inte kräver proffs eller utarbetade instrumentala inställningar12. Med andra ord kan personer som inte har särskild utbildning driva remsor eller självtester13. Resultaten av testet kan erhållas på 5 minuter, vilket innebär att det kan användas för platsinspektioner14. Dessutom, enligt våra beräkningar, kostnaden för remsor kan vara lägre än 1 RMB15, vilket innebär att testerna är billiga att främja16. Därför är ICS en relativt exakt, enkel och billig engångsenhet. ICSs baserade på kolloidalt guld17,18 tillämpas också i snabb COVID-19 upptäckt.
Principen om ICS kan delas in i sandwich ICS och konkurrenskraftiga ICS. Figur 1A är ett schematiskt diagram över smörgås-ICS, som huvudsakligen används för att upptäcka makromolekylära ämnen som proteiner, inklusive tumörmarkörer, inflammatoriska faktorer och humant koriongonotropin (HCG, tidig graviditetsantigen). I denna metod används parade antikroppar riktade mot olika epitoper av antigenet, och fångstantikroppen torkas på NC-membranet som en testlinje. Märkt antikropp torkas på konjugatdynan och sekundär antikropp används som kontrolllinje.
Figur 1B är ett schematiskt diagram över konkurrenskraftig ICS, som huvudsakligen används för att upptäcka små molekylämnen (MWCO < 2000 Da). Beläggningsantigenet är fastsatt på NC-membranet som en testlinje, och den märkta antikroppen torkas på konjugatdynan. Under detektion flödar provet och märkt antikropp genom detektionslinjen under kapillärverkan, och det belagda antigenet binder konkurrenskraftigt fritt antigen i provet och utvecklar en röd färg på detektionslinjen.
Nyligen beskrev vi förfarandet för monoklonal antikroppsgenerering mot naturliga produkter19. I detta arbete utvecklade vi ett nytt lateralt flöde immunoassay baserat på den förberedda anti-SSD mA20 för snabb upptäckt på plats. Resultaten tyder på att immunokromatografianalysen är ett oumbärligt och bekvämt verktyg för att upptäcka naturliga produktbaserade föreningar.
Figur 1 Schematiskt diagram över immunokromatografianalysen (A)Sandwich immunokromatografiska testremsor. B)Indirekta konkurrenskraftiga immunkromatografiska testremsor. Denna siffra har ändrats från Zhang et al., 201821. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta arbete presenterar vi ett protokoll för beredning av mAbs mot naturliga produktbaserade små molekyler. De väsentliga stegen och de frågor som behöver uppmärksammas i förfarandet har beskrivits, och vi har visat nyttan av detta protokoll med hjälp av den lilla molekylen SSD som exempel. Exempel på spektra, TEM-bilder, kvantitativa resultat och metodologiska undersökningar visas i representativa data. Därför har vi visat att den kolloidala guldproduktionen, AuNP-mAb konjugation och remsmonteringsstrateg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av de särskilda fonderna för grundforskningsfonder vid institutioner för högre lärande som är anslutna till centrala avdelningar. Vi uppskattar stödet från Classical Prescription Basic Research Team vid Beijing University of Chinese Medicine.
Materials
| Chloroauric acid solution (HAuCl4) | Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory | JY-SJ102 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| Filter paper | Sinopharm | H5072 | |
| Glass fibre membranes | Jieyi | XQ-Y6 | |
| goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| Nitrocellulose membranes | Millipore | millipore 180 | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG20000 | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Pipette 10mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25mL | FALCON | 357525 | |
| semi-rigid PVC sheets | Jieyi | JY-C104 | |
| Sodium citrate | Beijing Chemical Works | C1034 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Tris-HCl | Solarbio | 77-86-1 | |
| TWEEN 20 | Solarbio | 9005-64-5 |
References
- Huang, X., et al. Membrane-based lateral flow immunochromatographic strip with nanoparticles as reporters for detection: A review. Biosensors and Bioelectronics. 75, 166-180 (2016).
- Chang, H. -. F., Wang, J. -. Q., Wang, B., Deng, A. -. P. An immune chromatographic assay for rapid and simultaneous detection of levonorgestrel and methylprednisolone in water samples. Chinese Chemical Letters. 24 (10), 937-940 (2013).
- Lai, J. J., Stayton, P. S. Improving lateral-flow immunoassay (LFIA) diagnostics via biomarker enrichment for mHealth. Methods in Molecular Biology. 1256, 71-84 (2015).
- Zhang, M. Z., et al. Development of a colloidal gold-based lateral-flow immunoassay for the rapid simultaneous detection of clenbuterol and ractopamine in swine urine. Analytical & Bioanalytical Chemistry. 395 (8), 2591-2599 (2009).
- Kranthi, K. R., et al. Development of a colloidal-gold based lateral-flow immunoassay kit for ‘quality-control’ assessment of pyrethroid and endosulfan formulations in a novel single strip format. Crop Protection. 28 (5), 428-434 (2009).
- Qian, K., et al. Development and evaluation of an immunochromatographic strip for rapid detection of capsid protein antigen p27 of avian leukosis virus. Journal of Virological Methods. (221), 115-118 (2015).
- Guo, H., et al. Lateral flow immunoassay devices for testing saliva and other liquid samples and methods of use of same. US Patent. , (2003).
- Miočević, O., et al. Quantitative Lateral Flow Assays for Salivary Biomarker Assessment: A Review. Frontiers in Public Health. 5, 1-13 (2017).
- Lisa, M., et al. Gold nanoparticles based dipstick immunoassay for the rapid detection of dichlorodiphenyltrichloroethane: an organochlorine pesticide. Biosensors and Bioelectronics. 25 (1), 224-227 (2009).
- Zhang, Z., et al. Monoclonal Antibody-Europium Conjugate-Based Lateral Flow Time-Resolved Fluoroimmunoassay for Quantitative Determination of T-2 Toxin in Cereals and Feed. Analytical Methods. 7 (6), 2822-2829 (2015).
- Shen, H., et al. Facile synthesis of high-quality CuInZnxS2+x core/shell nanocrystals and their application for detection of C-reactive protein. Journal of Materials Chemistry. 22 (35), 18623-18630 (2012).
- Xiang, T., et al. A novel double antibody sandwich-lateral flow immunoassay for the rapid and simple detection of hepatitis C virus. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1041-1047 (2012).
- Yang, Q., et al. Quantum dot-based immunochromatography test strip for rapid, quantitative and sensitive detection of alpha fetoprotein. Biosensors & Bioelectronics. 30 (1), 145 (2011).
- Song, L. W., et al. Rapid fluorescent lateral-flow immunoassay for hepatitis B virus genotyping. Analytical Chemistry. 87, 5173-5180 (2015).
- Zhang, Y., et al. Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).
- Qu, H., et al. Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of GsRerarin. Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
- Li, Z., et al. Development and Clinical Application of a Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis. Journal of Medical Virology. 92 (9), (2020).
- Xiaomei, L., Jing, W., Ya, Z. The clinical application value analysis of the 2019-coronary virus disease was analyzed by the whole blood Sars-COV 2 specific antibody detection. Natural Science Edition. 42, (2020).
- Zhang, Y., et al. Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products. Journal of Visualized Experiments. , e57116 (2019).
- Sai, J., et al. Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Immunoaffinity Column Chromatography for Saikosaponin d Using an Anti-Saikosaponin d Monoclonal Antibody. Planta Medica. 82, 432-439 (2016).
- Yue, Z., et al. A Highly Sensitive Immunochromatographic Strip Test for Rapid and Quantitative Detection of Saikosaponin d. Molecules. 23 (2), 338 (2018).
- Qu, H., et al. Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of Puerarin. Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
- Zhang, Y., et al. Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).
