Küçük Molekül Bileşiklerinin Hızlı ve Nicel Tespiti için Yanal Akış İmmünokromatografik Şeridinin Geliştirilmesi
Abstract
Membran bazlı lateral akış immünokromatografik şeritler (ICSs) düşük maliyetli kendi kendine tanı için yararlı araçlardır ve toksin, fizyolojik indeks ve klinik biyobelirteç tespitine verimli bir şekilde uygulanmıştır. Bu protokolde, hızlı, hassas ve nicel yanal akışlı bir immünoassay geliştirme adımlarının ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz (AuNP’leri bir işaretleyici olarak ve mAb’leri prob olarak kullanarak). Prosedür kolloidal altının hazırlanmasını ve karakterizasyonunu, AuNP-mAb konjugesinin sentezini, immünromatografik şeridin montajını ve tahlil metodolojik incelemesini açıklar. Sonuçlar, son şeritlerin, fizyolojik ve biyolojik endekslerin hızlı ve hassas analizinde alternatif bir araç sağlayabilecek küçük bir molekülün hızlı ve rahat kendi kendine teşhisi için daha fazla kullanılabileceğini göstermiştir.
Introduction
Membran bazlı yanal akış immünokromatografik şeritler (ICSs) düşük maliyetli ve hızlı algılama için kullanışlı araçlardır. Taşıyıcı olarak nitroselüloz membran ve immün kromatografi hızlı tanı reaktiflerinin belirteçleri olarak kolloidal altın en sık kullanılan POCT (bakım noktası testi) yöntemidir ve projenin test kapsamı daha geniştir. Hamilelik sırasında izlemedeki orijinal uygulamalarından, kan pıhtılaşma durumu 1,2, miyokard yaralanması3, veteriner hekimlik4, pestisit kalıntıları5, bulaşıcı hastalıklar6ve ilaç konsantrasyonlarını izlemek için kullanımları genişletilmiştir. İdrar, tükürük, tam kan, serum ve diğer vücut sıvıları dahil olmak üzere daha fazla örnek türü değerlendirilebilir7,8,9.
Son yıllarda, hassas ve doğru, güvenilir ve spesifik olan HPLC, UPLC, LC-MS ve ELISA dahil olmak üzere bozuklukların tanısında biyobelirteçleri tespit etmek için çok sayıda yeni tahlil geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemler sofistike enstrümantasyon, karmaşık ön işleme ve zaman alıcı tedaviler gerektirir9. Bu nedenle, tıbbi aktif bileşiklerin kendi kendine ve gerçek zamanlı tespiti için daha hızlı ve kullanışlı bir bakım noktası tanı stratejisi geliştirmek acildir10,11.
ICS’lerin popülaritesi, özellikle yaygın testler için, profesyonellere veya ayrıntılı enstrümantal kurulumlara ihtiyaç duydukları için kullanım kolaylığından kaynaklanır12. Başka bir deyişle, özel eğitimi olmayan kişiler şeritleri veya kendi kendine testleri çalıştırabilir13. Testin sonuçları 5 dakika içinde elde edilebilir, bu da saha incelemeleri için kullanılabileceği anlamına gelir14. Ayrıca, hesaplamalarımıza göre, şeritlerin maliyeti 1 RMB15‘ten düşük olabilir , bu da testlerin16. Bu nedenle, ICS nispeten doğru, basit ve ucuz bir tek kullanımlık cihazdır. Kolloidal altın17,18 bazlı ICS’ler hızlı COVID-19 tespitinde de uygulanmaktadır.
ICS prensibi sandviç ICS ve rekabetçi ICS olarak ayrılabilir. Şekil 1A, esas olarak tümör belirteçleri, enflamatuar faktörler ve insan koryonik gonadotropin (HCG, erken gebelik antijeni) dahil olmak üzere proteinler gibi makromoleküler maddeleri tespit etmek için kullanılan sandviç ICS’nin şematik bir diyagramıdır. Bu yöntemde antijenin farklı epitoplarını hedefleyen eşleştirilmiş antikorlar kullanılır ve yakalama antikorı test hattı olarak NC membranında kurutulur. Etiketli antikor konjuge ped üzerinde kurutulur ve kontrol hattı olarak ikincil antikor kullanılır.
Şekil 1B, esas olarak küçük molekül maddeleri tespit etmek için kullanılan rekabetçi ICS’nin şematik bir diyagramıdır (MWCO < 2000 Da). Kaplama antijeni test hattı olarak NC membran üzerine sabitlenir ve etiketli antikor konjuge ped üzerinde kurutulur. Algılama sırasında, numune ve etiketli antikor kılcal etki altında algılama hattından akar ve kaplanmış antijen, numunedeki serbest antijeni rekabetçi bir şekilde bağlar ve algılama hattında kırmızı bir renk geliştirir.
Son zamanlarda, doğal ürünlere karşı monoklonal antikor üretimi prosedürünü tanımladık19. Bu çalışmada, hızlı ve yerinde tespit için hazırlanan anti-SSD mA20’ye dayanan yeni bir yanal akış immünoassay geliştirdik. Sonuçlar, immünokromatografi testinin doğal ürün türevi bileşikleri tespit etmek için vazgeçilmez ve kullanışlı bir araç olduğunu göstermektedir.
Şekil 1 İmmünromatografi testinin şematik şeması (A) Sandviç immünokromatografik test şeritleri. (B) Dolaylı rekabetçi immün kromatografik test şeritleri. Bu rakam Zhang ve ark.,201821. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, mAb’lerin doğal ürün türevi küçük moleküllere karşı hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Prosedürde dikkat gereken temel adımlar ve konular özetlenmiştir ve örnek olarak küçük molekül SSD’yi kullanarak bu protokolün yararını gösterdik. Örnek spektrumlar, TEM görüntüleri, nicel sonuçlar ve metodolojik araştırmalar temsili verilerde gösterilmiştir. Bu nedenle, burada sunulan kolloidal altın üretimi, AuNP-mAb konjugasyon ve şerit montaj stratejisinin hedef molekül…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, merkezi bölümlere bağlı yüksek öğrenim kurumlarının Temel Araştırma Fonları için Özel Fonlar tarafından desteklenmiştir. Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi Klasik Reçete Temel Araştırma Ekibinin desteğini takdir ediyoruz.
Materials
| Chloroauric acid solution (HAuCl4) | Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory | JY-SJ102 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| Filter paper | Sinopharm | H5072 | |
| Glass fibre membranes | Jieyi | XQ-Y6 | |
| goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| Nitrocellulose membranes | Millipore | millipore 180 | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG20000 | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Pipette 10mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25mL | FALCON | 357525 | |
| semi-rigid PVC sheets | Jieyi | JY-C104 | |
| Sodium citrate | Beijing Chemical Works | C1034 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Tris-HCl | Solarbio | 77-86-1 | |
| TWEEN 20 | Solarbio | 9005-64-5 |
References
- Huang, X., et al. Membrane-based lateral flow immunochromatographic strip with nanoparticles as reporters for detection: A review. Biosensors and Bioelectronics. 75, 166-180 (2016).
- Chang, H. -. F., Wang, J. -. Q., Wang, B., Deng, A. -. P. An immune chromatographic assay for rapid and simultaneous detection of levonorgestrel and methylprednisolone in water samples. Chinese Chemical Letters. 24 (10), 937-940 (2013).
- Lai, J. J., Stayton, P. S. Improving lateral-flow immunoassay (LFIA) diagnostics via biomarker enrichment for mHealth. Methods in Molecular Biology. 1256, 71-84 (2015).
- Zhang, M. Z., et al. Development of a colloidal gold-based lateral-flow immunoassay for the rapid simultaneous detection of clenbuterol and ractopamine in swine urine. Analytical & Bioanalytical Chemistry. 395 (8), 2591-2599 (2009).
- Kranthi, K. R., et al. Development of a colloidal-gold based lateral-flow immunoassay kit for ‘quality-control’ assessment of pyrethroid and endosulfan formulations in a novel single strip format. Crop Protection. 28 (5), 428-434 (2009).
- Qian, K., et al. Development and evaluation of an immunochromatographic strip for rapid detection of capsid protein antigen p27 of avian leukosis virus. Journal of Virological Methods. (221), 115-118 (2015).
- Guo, H., et al. Lateral flow immunoassay devices for testing saliva and other liquid samples and methods of use of same. US Patent. , (2003).
- Miočević, O., et al. Quantitative Lateral Flow Assays for Salivary Biomarker Assessment: A Review. Frontiers in Public Health. 5, 1-13 (2017).
- Lisa, M., et al. Gold nanoparticles based dipstick immunoassay for the rapid detection of dichlorodiphenyltrichloroethane: an organochlorine pesticide. Biosensors and Bioelectronics. 25 (1), 224-227 (2009).
- Zhang, Z., et al. Monoclonal Antibody-Europium Conjugate-Based Lateral Flow Time-Resolved Fluoroimmunoassay for Quantitative Determination of T-2 Toxin in Cereals and Feed. Analytical Methods. 7 (6), 2822-2829 (2015).
- Shen, H., et al. Facile synthesis of high-quality CuInZnxS2+x core/shell nanocrystals and their application for detection of C-reactive protein. Journal of Materials Chemistry. 22 (35), 18623-18630 (2012).
- Xiang, T., et al. A novel double antibody sandwich-lateral flow immunoassay for the rapid and simple detection of hepatitis C virus. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1041-1047 (2012).
- Yang, Q., et al. Quantum dot-based immunochromatography test strip for rapid, quantitative and sensitive detection of alpha fetoprotein. Biosensors & Bioelectronics. 30 (1), 145 (2011).
- Song, L. W., et al. Rapid fluorescent lateral-flow immunoassay for hepatitis B virus genotyping. Analytical Chemistry. 87, 5173-5180 (2015).
- Zhang, Y., et al. Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).
- Qu, H., et al. Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of GsRerarin. Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
- Li, Z., et al. Development and Clinical Application of a Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis. Journal of Medical Virology. 92 (9), (2020).
- Xiaomei, L., Jing, W., Ya, Z. The clinical application value analysis of the 2019-coronary virus disease was analyzed by the whole blood Sars-COV 2 specific antibody detection. Natural Science Edition. 42, (2020).
- Zhang, Y., et al. Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products. Journal of Visualized Experiments. , e57116 (2019).
- Sai, J., et al. Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Immunoaffinity Column Chromatography for Saikosaponin d Using an Anti-Saikosaponin d Monoclonal Antibody. Planta Medica. 82, 432-439 (2016).
- Yue, Z., et al. A Highly Sensitive Immunochromatographic Strip Test for Rapid and Quantitative Detection of Saikosaponin d. Molecules. 23 (2), 338 (2018).
- Qu, H., et al. Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of Puerarin. Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
- Zhang, Y., et al. Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).
