جيل من الأعضاء الدماغ البشري لنمذجة مرض الميتوكوندريا
Summary
نحن نصف بروتوكول مفصل لتوليد الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة البشرية المستمدة من أعضاء الدماغ واستخدامها في نمذجة أمراض الميتوكوندريا.
Abstract
أمراض الميتوكوندريا تمثل أكبر فئة من الأخطاء الجنينية في التمثيل الغذائي وغير قابلة للشفاء حاليا. هذه الأمراض تسبب عيوب نمائية عصبية لا تزال آلياتها الأساسية في حالة توضيح. حاجز رئيسي هو عدم وجود نماذج فعالة تلخيص ضعف الخلايا العصبية في وقت مبكر ينظر في المرضى. يتيح التقدم في تكنولوجيا الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) توليد أعضاء دماغية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) يمكن استخدامها للتحقيق في تأثير الأمراض على تطور الجهاز العصبي وتنظيمه. وقد أدخل الباحثون، بما في ذلك هؤلاء المؤلفين، مؤخرا organoids الدماغ البشري لنموذج اضطرابات الميتوكوندريا. هذه الورقة تقارير بروتوكول مفصل للجيل قوية من الأعضاء الدماغ المستمدة من iPSC الإنسان واستخدامها في التنميط الحيوي الميتوكوندريا وتحليلات التصوير. هذه التجارب سوف تسمح باستخدام organoids الدماغ للتحقيق في الاختلالات الأيضية والتنموية، ويمكن أن توفر معلومات حاسمة لتشريح الأمراض العصبية من أمراض الميتوكوندريا.
Introduction
أمراض الميتوكوندريا تمثل أكبر فئة من الأخطاء الجنينية من التمثيل الغذائي1. وهي ناجمة عن الطفرات الوراثية التي تعطل عمليات الميتوكوندريا المختلفة، بما في ذلك الفوسفور التأكسدي (OXPHOS)2، وتجميع سلسلة الجهاز التنفسي، وديناميات الميتوكوندريا، ونسخ الحمض النووي الميتوكوندريا أو النسخ المتماثل3. تتأثر الأنسجة ذات متطلبات الطاقة بشكل خاص بخلل الميتوكوندريا4. وبناء على ذلك، فإن المرضى الذين يعانون من أمراض الميتوكوندريا عادة ما يطورون مظاهر عصبية مبكرة.
لا توجد حاليا علاجات متاحة للأطفال المصابين بأمراض الميتوكوندريا5. عائق رئيسي لتطوير المخدرات من أمراض الميتوكوندريا هو عدم وجود نماذج فعالة تلخيص مسار المرض البشري6. العديد من النماذج الحيوانية التي تمت دراستها حاليا لا تظهر العيوب العصبية الموجودة في المرضى7. وبالتالي ، فإن الآليات الكامنة وراء أمراض الخلايا العصبية لأمراض الميتوكوندريا لا تزال غير مفهومة تماما.
الدراسات الحديثة ولدت iPSCs من المرضى المتضررين من أمراض الميتوكوندريا واستخدمت هذه الخلايا للحصول على خلايا عصبية خاصة بالمرضى. على سبيل المثال، تم العثور على العيوب الوراثية المرتبطة بمرض الميتوكوندريا، متلازمة لي، تسبب انحرافات في الجيوجيات الحيوية الخلوية8،9، تخليق البروتين10، والكالسيوم homeostasis9،11. قدمت هذه التقارير أدلة ميكانيكية مهمة على ضعف الخلايا العصبية التي تحدث في أمراض الميتوكوندريا ، مما يمهد الطريق لاكتشاف الأدوية لهذه الأمراض المستعصية12.
الثقافات ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) ، ومع ذلك ، لا تمكن من التحقيق في التعقيد المعماري والتنظيم الإقليمي للأجهزة ثلاثية الأبعاد13. وتحقيقا لهذه الغاية، فإن استخدام الأعضاء العضوية ثلاثية الأبعاد في الدماغ المستمدة من iPSCs14 الخاصة بالمرضى قد يسمح للباحثين بالحصول على معلومات إضافية مهمة وبالتالي المساعدة في تشريح كيفية تأثير أمراض الميتوكوندريا على تطور الجهاز العصبي ووظيفته15. بدأت الدراسات التي تستخدم الأعضاء المشتقة من الدماغ iPSC للتحقيق في أمراض الميتوكوندريا في الكشف عن المكونات العصبية النمائية لأمراض الميتوكوندريا.
أظهرت الأجهزة العضوية في الحبل الشوكي التي تحمل طفرات مرتبطة بمرض الميتوكوندريا واعتلال الدماغ الميتوكوندريا وحمض اللاكتيك ومتلازمة الحلقات الشبيهة بالسكتة الدماغية (MELAS) وجود خلل في تكوين الأعصاب وتمايز الخلايا العصبية الحركية المتأخر16. أظهرت الأجهزة العضوية القشرية المشتقة من المرضى الذين يعانون من مرض الميتوكوندريا ، متلازمة لي ، انخفاضا في الحجم ، وعيوبا في توليد البراعم الظهارية العصبية ، وفقدان العمارة القشرية17. أظهرت أعضاء الدماغ من مرضى متلازمة لي أن عيوب المرض تبدأ على مستوى خلايا السلف العصبية ، والتي لا يمكن أن تلتزم بعملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا ، مما يسبب تفريع الخلايا العصبية الشاذة والمورفوجينيس18. وهكذا، قد تمثل السلف العصبية هدفا علاجيا خلويا لأمراض الميتوكوندريا، وقد تدعم الاستراتيجيات التي تعزز وظيفتها الميتوكوندريا التطور الوظيفي للجهاز العصبي.
قد يساعد استخدام الأعضاء العضوية في الدماغ في الكشف عن المكونات العصبية النمائية لأمراض الميتوكوندريا. تعتبر أمراض الميتوكوندريا بشكل رئيسي تنكس عصبي مبكر5. ومع ذلك ، توجد عيوب نمائية عصبية أيضا في المرضى المتضررين من أمراض الميتوكوندريا ، بما في ذلك تأخر النمو وضعف الإدراك19. قد تساعد الأعضاء العضوية الدماغية الخاصة بمرضى معينين في معالجة هذه الجوانب وتوضيح كيفية تأثير أمراض الميتوكوندريا على نمو الدماغ البشري. يمكن أن يلعب خلل الميتوكوندريا أيضا دورا مسببا للأمراض في الأمراض العصبية الأخرى الأكثر شيوعا ، مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون ومرض هنتنغتون4. وبالتالي ، فإن توضيح تأثير عيوب الميتوكوندريا في النمو العصبي باستخدام أعضاء الدماغ قد يكون مفيدا أيضا لدراسة تلك الأمراض. تصف هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لتوليد أعضاء الدماغ القابلة للاستنساخ التي يمكن استخدامها لإجراء نمذجة الأمراض لأمراض الميتوكوندريا.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه الورقة الجيل القابل للاستنساخ من الأعضاء العضوية البشرية المشتقة من الدماغ iPSC واستخدامها لنمذجة أمراض الميتوكوندريا. يتم تعديل البروتوكول الموضح هنا استنادا إلى work20 المنشورة مسبقا. وإحدى المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه لا يتطلب التضمين اليدوي لكل عضو عضوي ف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ميريام بونينج على الدعم الفني. نعترف بالدعم المقدم من دويتشه فوردشونجسجيمينشافت (DFG) (PR1527/5-1 إلى A.P.) وS spark ومعهد برلين للصحة (BIH) (صناديق التحقق من صحة BIH إلى A.P.) ، ويونايتد مؤسسة أمراض الميتوكوندريا (UMDF) (منحة الاتحاد الدولي لمتلازمة لي ل A.P.)، مستشفى دوسلدورف الجامعي (Forschungskommission UKD إلى A.P.)، ووزارة التعليم والبحوث الاتحادية الألمانية (BMBF) (e: بيو الشباب المحقق منح AZ 031L0211 إلى A.P.). تم دعم العمل في مختبر C.R.R. من قبل DFG (FOR 2795 “نقاط الاشتباك العصبي تحت الضغط”، Ro 2327/13-1).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
| Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
| Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
| Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
| Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Sodium chloride | Roth | 3957 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
References
- Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080 (2016).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
- Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
- Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
- Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
- Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
- Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).
- Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378 (2016).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
- Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
- Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).
- Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
- Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).
- Falk, M. J. Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease. Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
- Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).
- Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760 (2020).
- Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
