Generatie van organoïden in de menselijke hersenen voor mitochondriale ziektemodellering
Summary
We beschrijven een gedetailleerd protocol voor het genereren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hersenorganoïden en hun gebruik bij het modelleren van mitochondriale ziekten.
Abstract
Mitochondriale ziekten vertegenwoordigen de grootste klasse van aangeboren fouten van het metabolisme en zijn momenteel ongeneeslijk. Deze ziekten veroorzaken neurologische ontwikkelingsdefecten waarvan de onderliggende mechanismen nog moeten worden opgehelderd. Een belangrijke wegversperring is het gebrek aan effectieve modellen die de neuronale stoornis met vroege aanvang bij de patiënten samenvatten. Vooruitgang in de technologie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) maakt het mogelijk om driedimensionale (3D) hersenorganoïden te genereren die kunnen worden gebruikt om de impact van ziekten op de ontwikkeling en organisatie van het zenuwstelsel te onderzoeken. Onderzoekers, waaronder deze auteurs, hebben onlangs menselijke hersenorganoïden geïntroduceerd om mitochondriale aandoeningen te modelleren. Dit artikel rapporteert een gedetailleerd protocol voor de robuuste generatie van menselijke iPSC-afgeleide hersenorganoïden en hun gebruik in mitochondriale bio-energetische profilering en beeldvormingsanalyses. Deze experimenten zullen het gebruik van hersenorganoïden mogelijk maken om metabole en ontwikkelingsstoornissen te onderzoeken en kunnen cruciale informatie opleveren om de neuronale pathologie van mitochondriale ziekten te ontleden.
Introduction
Mitochondriale ziekten vertegenwoordigen de grootste klasse van aangeboren fouten van het metabolisme1. Ze worden veroorzaakt door genetische mutaties die verschillende mitochondriale processen verstoren, waaronder oxidatieve fosforylering (OXPHOS)2, ademhalingsketenassemblage, mitochondriale dynamica en mitochondriale DNA-transcriptie of –replicatie3. Weefsels met energiebehoeften worden in het bijzonder beïnvloed door mitochondriale disfunctie4. Dienovereenkomstig ontwikkelen patiënten met mitochondriale ziekten meestal neurologische manifestaties met vroege aanvang.
Er zijn momenteel geen behandelingen beschikbaar voor kinderen met mitochondriale ziekten5. Een belangrijke belemmering voor de ontwikkeling van mitochondriale ziekten door geneesmiddelen is het gebrek aan effectieve modellen die het verloop van de menselijke ziekte samenvatten6. Verschillende van de momenteel bestudeerde diermodellen vertonen niet de neurologische defecten die bij de patiënten aanwezig zijn7. Vandaar dat de mechanismen die ten grondslag liggen aan de neuronale pathologie van mitochondriale ziekten nog steeds niet volledig worden begrepen.
Recente studies genereerden iPSC’s van patiënten met mitochondriale ziekten en gebruikten deze cellen om patiëntspecifieke neuronale cellen te verkrijgen. Genetische defecten geassocieerd met de mitochondriale ziekte, het syndroom van Leigh, blijken bijvoorbeeld afwijkingen te veroorzaken in cellulaire bio-energetica8,9, eiwitsynthese10 en calciumhomeostase9,11. Deze rapporten gaven belangrijke mechanistische aanwijzingen over de neuronale stoornis die optreedt bij mitochondriale ziekten, waardoor de weg werd vrijgemaakt voor de ontdekking van geneesmiddelen voor deze ongeneeslijke ziekten12.
Tweedimensionale (2D) culturen maken het echter niet mogelijk om de architecturale complexiteit en regionale organisatie van 3D-organen te onderzoeken13. Hiertoe kan het gebruik van 3D-hersenorganoïden afgeleid van patiëntspecifieke iPSCs14 onderzoekers in staat stellen aanvullende belangrijke informatie te verkrijgen en daardoor te helpen ontleden hoe mitochondriale ziekten de ontwikkeling en functie van het zenuwstelsel beïnvloeden15. Studies met iPSC-afgeleide hersenorganoïden om mitochondriale ziekten te onderzoeken, beginnen de neurologische ontwikkelingscomponenten van mitochondriale ziekten te ontdekken.
Ruggenmergorganoïden met mutaties geassocieerd met de mitochondriale ziekte, mitochondriale encefalopathie, lactaatacidose en beroerte-achtige episodes syndroom (MELAS), vertoonden defecte neurogenese en vertraagde differentiatie van motorneuronen16. Corticale organoïden afgeleid van patiënten met de mitochondriale ziekte, Leigh-syndroom, vertoonden verminderde omvang, defecten in neurale epitheliale knopgeneratie en verlies van corticale architectuur17. Hersenorganoïden van patiënten met het Leigh-syndroom toonden aan dat de ziektedefecten initiëren op het niveau van neurale voorlopercellen, die zich niet kunnen binden aan mitochondriaal metabolisme, waardoor afwijkende neuronale vertakkingen en morfogenese18 ontstaan. Neurale voorlopers kunnen dus een cellulair therapeutisch doelwit vormen voor mitochondriale ziekten, en strategieën die hun mitochondriale functie bevorderen, kunnen de functionele ontwikkeling van het zenuwstelsel ondersteunen.
Het gebruik van hersenorganoïden kan helpen bij het blootleggen van de neurologische ontwikkelingscomponenten van mitochondriale ziekten. Mitochondriale ziekten worden voornamelijk beschouwd als neurodegeneratie met vroege aanvang5. Neurologische ontwikkelingsstoornissen zijn echter ook aanwezig bij patiënten die worden getroffen door mitochondriale ziekten, waaronder ontwikkelingsachterstand en cognitieve stoornissen19. Patiëntspecifieke hersenorganoïden kunnen helpen deze aspecten aan te pakken en op te helderen hoe mitochondriale ziekten de ontwikkeling van de menselijke hersenen kunnen beïnvloeden. Mitochondriale disfunctie kan ook een pathogenetische rol spelen bij andere, meer voorkomende neurologische ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson en de ziekte van Huntington4. Vandaar dat het ophelderen van de impact van mitochondriale defecten in de neurologische ontwikkeling met behulp van hersenorganoïden ook instrumenteel kan zijn voor de studie van die ziekten. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het genereren van reproduceerbare hersenorganoïden die kunnen worden gebruikt voor het uitvoeren van ziektemodellering van mitochondriale ziekten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft de reproduceerbare generatie van menselijke iPSC-afgeleide hersenorganoïden en hun gebruik voor mitochondriale ziektemodellering. Het hier beschreven protocol is aangepast op basis van een eerder gepubliceerd werk20. Een groot voordeel van het huidige protocol is dat het niet vereist dat elke organoïde handmatig in een steigermatrix wordt ingesloten. In feite wordt de matrixoplossing eenvoudig opgelost in het celkweekmedium. Bovendien is het niet nodig om dure bioreactoren…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Miriam Bünning voor de technische ondersteuning. We erkennen de steun van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 aan A.P.), Spark en Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), de United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD to A.P.) en het Duitse federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) (e: Bio jonge onderzoeker subsidie AZ 031L0211 aan A.P.). Het werk in het laboratorium van C.R.R. werd ondersteund door de DFG (FOR 2795 “Synapsen under stress”, Ro 2327/13-1).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
| Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
| Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
| Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
| Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Sodium chloride | Roth | 3957 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
References
- Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080 (2016).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
- Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
- Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
- Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
- Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
- Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).
- Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378 (2016).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
- Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
- Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).
- Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
- Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).
- Falk, M. J. Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease. Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
- Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).
- Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760 (2020).
- Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
