Generierung menschlicher Gehirnorganoide für die mitochondriale Krankheitsmodellierung
Summary
Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Hirnorganoiden und deren Verwendung bei der Modellierung mitochondrialer Erkrankungen.
Abstract
Mitochondriale Erkrankungen stellen die größte Klasse angeborener Stoffwechselstörungen dar und sind derzeit unheilbar. Diese Erkrankungen verursachen neurologische Entwicklungsdefekte, deren zugrunde liegende Mechanismen noch aufgeklärt werden müssen. Ein Haupthindernis ist der Mangel an effektiven Modellen, die die früh einsetzende neuronale Beeinträchtigung der Patienten rekapitulieren. Fortschritte in der Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) ermöglichen die Erzeugung von dreidimensionalen (3D) Hirnorganoiden, mit denen die Auswirkungen von Krankheiten auf die Entwicklung und Organisation des Nervensystems untersucht werden können. Forscher, einschließlich dieser Autoren, haben kürzlich menschliche Gehirnorganoide eingeführt, um mitochondriale Störungen zu modellieren. Dieser Artikel berichtet über ein detailliertes Protokoll für die robuste Erzeugung von humanen iPSC-abgeleiteten Gehirnorganoiden und deren Verwendung in mitochondrialen bioenergetischen Profiling- und Bildgebungsanalysen. Diese Experimente werden die Verwendung von Gehirnorganoiden zur Untersuchung von Stoffwechsel- und Entwicklungsstörungen ermöglichen und können entscheidende Informationen liefern, um die neuronale Pathologie mitochondrialer Erkrankungen zu sezieren.
Introduction
Mitochondriale Erkrankungen stellen die größte Klasse angeborener Stoffwechselstörungen dar1. Sie werden durch genetische Mutationen verursacht, die verschiedene mitochondriale Prozesse stören, einschließlich oxidativer Phosphorylierung (OXPHOS)2, Assemblierung der Atmungskette, mitochondrialer Dynamik und mitochondrialer DNA-Transkription oder -Replikation3. Gewebe mit Energiebedarf sind besonders von mitochondrialer Dysfunktion betroffen4. Dementsprechend entwickeln Patienten mit mitochondrialen Erkrankungen typischerweise früh einsetzende neurologische Manifestationen.
Derzeit gibt es keine Behandlungen für Kinder, die von mitochondrialen Erkrankungen betroffen sind5. Ein Haupthindernis für die Entwicklung von Medikamenten mitochondrialen Erkrankungen ist das Fehlen wirksamer Modelle, die den menschlichen Krankheitsverlauf rekapitulieren6. Einige der derzeit untersuchten Tiermodelle weisen die bei den Patienten vorhandenen neurologischen Defekte nicht auf7. Daher sind die Mechanismen, die der neuronalen Pathologie mitochondrialer Erkrankungen zugrunde liegen, noch nicht vollständig verstanden.
Neuere Studien erzeugten iPS-Zellen von Patienten, die von mitochondrialen Erkrankungen betroffen waren, und verwendeten diese Zellen, um patientenspezifische neuronale Zellen zu erhalten. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass genetische Defekte, die mit der mitochondrialen Erkrankung, dem Leigh-Syndrom, assoziiert sind, Aberrationen in der zellulären Bioenergetik8,9, der Proteinsynthese10 und der Calciumhomöostase9,11 verursachen. Diese Berichte lieferten wichtige mechanistische Hinweise auf die neuronale Beeinträchtigung bei mitochondrialen Erkrankungen und ebneten den Weg für die Wirkstoffforschung für diese unheilbaren Krankheiten12.
Zweidimensionale (2D)Kulturen erlauben jedoch keine Untersuchung der architektonischen Komplexität und regionalen Organisation von 3D-Organen13. Zu diesem Zweck kann die Verwendung von 3D-Hirnorganoiden, die aus patientenspezifischen iPS-Zellen14 abgeleitet sind, es den Forschern ermöglichen, zusätzliche wichtige Informationen zu gewinnen und so zu analysieren, wie mitochondriale Erkrankungen die Entwicklung und Funktion des Nervensystems beeinflussen15. Studien, die iPSC-abgeleitete Gehirnorganoide zur Untersuchung mitochondrialer Erkrankungen einsetzen, beginnen, die neurologischen Entwicklungskomponenten mitochondrialer Erkrankungen aufzudecken.
Rückenmarksorganoide, die Mutationen im Zusammenhang mit der mitochondrialen Erkrankung, der mitochondrialen Enzephalopathie, der Laktatazidose und dem Schlaganfall-ähnlichen Episodensyndrom (MELAS) tragen, zeigten eine fehlerhafte Neurogenese und eine verzögerte Motoneurondifferenzierung16. Kortikale Organoide, die von Patienten mit der mitochondrialen Erkrankung, dem Leigh-Syndrom, stammen, zeigten eine reduzierte Größe, Defekte in der neuronalen Epithelknospenbildung und einen Verlust der kortikalen Architektur17. Gehirnorganoide von Patienten mit Leigh-Syndrom zeigten, dass die Krankheitsdefekte auf der Ebene neuronaler Vorläuferzellen beginnen, die sich nicht an den mitochondrialen Stoffwechsel binden können, was zu einer aberranten neuronalen Verzweigung und Morphogenese führt18. So können neuronale Vorläufer ein zelluläres therapeutisches Ziel für mitochondriale Erkrankungen darstellen, und Strategien, die ihre mitochondriale Funktion fördern, können die funktionelle Entwicklung des Nervensystems unterstützen.
Die Verwendung von Gehirnorganoiden könnte helfen, die neurologischen Entwicklungskomponenten von mitochondrialen Erkrankungen aufzudecken. Mitochondriale Erkrankungen werden hauptsächlich als früh einsetzende Neurodegeneration angesehen5. Neuroentwicklungsstörungen treten jedoch auch bei Patienten auf, die von mitochondrialen Erkrankungen betroffen sind, einschließlich Entwicklungsverzögerung und kognitiver Beeinträchtigung19. Patientenspezifische Gehirnorganoide können helfen, diese Aspekte anzugehen und aufzuklären, wie mitochondriale Erkrankungen die Entwicklung des menschlichen Gehirns beeinflussen können. Mitochondriale Dysfunktion könnte auch eine pathogenetische Rolle bei anderen häufigeren neurologischen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit und der Huntington-Krankheit4 spielen. Daher könnte die Aufklärung der Auswirkungen von mitochondrialen Defekten auf die Neuroentwicklung unter Verwendung von Gehirnorganoiden auch für die Untersuchung dieser Krankheiten von entscheidender Bedeutung sein. Dieses Papier beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung reproduzierbarer Gehirnorganoide, die für die Durchführung der Krankheitsmodellierung von mitochondrialen Erkrankungen verwendet werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Artikel beschreibt die reproduzierbare Erzeugung von humanen iPSC-abgeleiteten Gehirnorganoiden und deren Verwendung für die mitochondriale Krankheitsmodellierung. Das hier beschriebene Protokoll wurde auf der Grundlage einer zuvor veröffentlichten Arbeit modifiziert20. Ein großer Vorteil des vorliegenden Protokolls besteht darin, dass es nicht die manuelle Einbettung jedes Organoids in eine Gerüstmatrix erfordert. Tatsächlich wird die Matrixlösung einfach in das Zellkulturmedium gel?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Miriam Bünning für die technische Unterstützung. Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 an A.P.), Spark und dem Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds an A.P.), der United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant an A.P.), dem Universitätsklinikum Düsseldorf (Forschungskommission UKD an A.P.) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) (d: Bio Young Investigator Grant AZ 031L0211 an A.P.). Die Arbeiten im Labor von C.R.R. wurden von der DFG gefördert (FOR 2795 “Synapsen unter Stress”, Ro 2327/13-1).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
| Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
| Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
| Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
| Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Sodium chloride | Roth | 3957 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
References
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