미토콘드리아 질환 모델링을 위한 인간 뇌 오르가노이드 생성
Summary
우리는 인간 유도된 다능성 줄기 세포 유래 두뇌 organoids의 생성을 위한 상세한 프로토콜및 미토콘드리아 질병을 모델링에 그들의 사용을 기술합니다.
Abstract
미토콘드리아 질환은 신진 대사의 태아 오류의 가장 큰 클래스를 나타내며 현재 불치입니다. 이 질병은 그 근본적인 기계장치가 해명될 남아 있는 신경 발달 결함을 일으키는 원인이 됩니다. 주요 장애물은 환자에서 볼 수있는 초기 발병 신경 장애를 재구성 하는 효과적인 모델의 부족. 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)의 기술의 발전은 신경계의 발달 및 조직에 대한 질병의 영향을 조사하는 데 사용될 수 있는 3차원(3D) 뇌 오르가노이드의 생성을 가능하게 한다. 연구원은, 이 저자를 포함하여, 최근에 미토콘드리아 무질서를 모형하기 위하여 인간 적인 두뇌 오르가노이드를 소개했습니다. 이 논문은 인간 iPSC 유래 뇌 오르가노이드의 견고한 생성과 미토콘드리아 생물 학적 프로파일링 및 이미징 분석에서의 사용에 대한 상세한 프로토콜을보고합니다. 이 실험은 신진 대사 및 발달 기능 장애를 조사하기 위하여 두뇌 organoids의 사용을 허용할 것입니다 미토콘드리아 질병의 신경 병리를 해부하기 위하여 중요한 정보를 제공할 수 있습니다.
Introduction
미토콘드리아 질환은 신진 대사의 태아 오류의 가장 큰 클래스를 나타냅니다1. 그(것)들은 산화 인산화 (OXPHOS)2, 호흡 사슬 조립, 미토콘드리아 역학 및 미토콘드리아 DNA 전사 또는 복제를 포함하여 다른 미토콘드리아 프로세스를 방해하는 유전 돌연변이에 기인합니다 3. 에너지 요구 사항이있는 조직은 특히 미토콘드리아 기능 장애4에 의해 영향을받습니다. 따라서 미토콘드리아 질환을 가진 환자는 일반적으로 조기 발병 신경 학적 증상을 개발합니다.
미토콘드리아 질환에 걸린 어린이에게는 현재 치료법이 없습니다5. 미토콘드리아 질환의 약물 개발을 위한 주요 장애물은 인간 질병 과정을 재구성하는 효과적인 모형의 부족입니다6. 현재 연구된 동물 모델 중 일부는 환자에서 존재하는 신경학적 결함을 나타내지 않는다7. 따라서 미토콘드리아 질환의 신경 병리학의 기본 메커니즘은 여전히 완전히 이해되지 않습니다.
최근 연구는 미토콘드리아 질환에 의해 영향을 받는 환자에서 iPSC를 생성 하 고 환자 특정 신경 세포를 얻기 위해 이러한 세포를 사용. 예를 들어, 미토콘드리아 질환, 리 증후군과 관련된 유전적 결함은 세포 생체 에너지8,9, 단백질 합성10 및 칼슘 항상성9,11에서 수차를 일으키는 것으로 밝혀졌다. 이 보고는 미토콘드리아 질병에서 생기는 신경 손상에 중요한 기계론단서를 제공했습니다, 이 불치병을 위한 약 발견을 위한 도로를 포장12.
그러나 2차원(2D) 문화는 3D 기관의 건축복잡성및 지역조직에 대한 조사를 가능하게 하지 않는다13. 이를 위해 환자별 iPSCs14 에서 추출한 3D 뇌 오르가노이드를 사용하면 연구원이 추가적인 중요한 정보를 얻을 수 있으며 이로 인해 미토콘드리아 질환이 신경계의 개발 및 기능에 미치는 영향을 해부하는 데 도움이 될 수 있습니다15. 미토콘드리아 질환을 조사하기 위해 iPSC 유래 뇌 오르가노이드를 사용하는 연구는 미토콘드리아 질환의 신경 발달 성분을 밝히기 시작했다.
미토콘드리아 질환, 미토콘드리아 뇌병증, 젖산증 및 뇌졸중과 같은 에피소드 증후군(MELAS)과 관련된 돌연변이를 운반하는 척수 오르가노이드는 결함이 있는 신경 발생 및 지연된 운동 뉴런 분화를 보였다16. 미토콘드리아 질환, 리 증후군 환자에서 유래한 피질 오르간노이드는 크기 감소, 신경 상피 싹 생성의 결함 및 피질 아키텍처의 손실을 보였다17. 리 증후군 환자에서 뇌 오르가노이드는 질병 결함이 미토콘드리아 대사에 투입 할 수없는 신경 전구 세포의 수준에서 시작 것으로 나타났다, 비정상적인 신경 분지 및 형태 발생을 일으키는 18. 따라서, 신경 전조자는 미토콘드리아 질환에 대한 세포 치료 표적을 나타낼 수 있으며, 미토콘드리아 기능을 촉진하는 전략은 신경계의 기능적 발달을 지원할 수 있다.
뇌 오르가노이드의 사용은 미토콘드리아 질환의 신경 발달 성분을 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다. 미토콘드리아 질환은 주로 조기 발병 신경 변성5로 간주됩니다. 그러나, 신경 발달 결점은 또한 발달 지연 및 인지 장애를 포함하여 미토콘드리아 질병에 의해 영향을 받은 환자에서 존재합니다19. 환자 별 뇌 오르가노이드는 이러한 측면을 해결하고 미토콘드리아 질환이 인간의 뇌 발달에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 설명합니다. 미토콘드리아 기능 장애는 또한 알츠하이머 병, 파킨슨 병 및 헌팅턴병4와 같은 다른 일반적인 신경 질환에서 병역적 역할을 할 수 있습니다. 따라서 뇌 오르가노이드를 사용하여 신경 발달에 미토콘드리아 결함의 영향을 해명하는 것도 이러한 질병의 연구에 도움이 될 수 있습니다. 이 논문은 미토콘드리아 질환의 질병 모델링을 수행하는 데 사용할 수있는 재현 가능한 뇌 오르가노이드를 생성하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문은 인간 iPSC 유래 뇌 오르가노이드의 재현 가능한 생성과 미토콘드리아 질환 모델링에 대한 사용을 설명합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 이전에 게시된 work20에 따라 수정됩니다. 본 프로토콜의 한 가지 주요 장점은 각 오르가노이드의 수동 포함을 비계 매트릭스에 포함시키지 않는다는 것입니다. 실제로, 매트릭스 용액은 단순히 세포 배양 배지에 용해된다. 더욱이, 고…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
기술 지원을 위해 미리암 뷔닝에게 감사드립니다. 우리는 도이치 포르충스게마인샤프트(DFG)(PR1527/5-1 ~A.P.), 스파크 및 베를린 보건연구소(BIH)(BIH 유효성 검사 기금 A.P.), 유나이티드 미의 지원을 인정합니다. 토콘드리아 질병 재단 (UMDF) (A.P.에 리 증후군 국제 컨소시엄 보조금), 대학 병원 뒤셀도르프 (Forschungskommission UKD 에 A.P.), 독일 연방 교육 및 연구부 (BMBF) (e: 바이오 젊은 조사관은 A.P.에 AZ 031L0211을 부여합니다. C.R.R.의 실험실에서 의 작업은 DFG에 의해 지원되었다 (FOR 2795 “스트레스아래 시냅스”, Ro 2327/13-1).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
| Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
| Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
| Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
| Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Sodium chloride | Roth | 3957 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
References
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