Geração de Organoides cerebrais humanos para modelagem de doenças mitocondriais
Summary
Descrevemos um protocolo detalhado para a geração de organoides cerebrais pluripotentes induzidos por células-tronco induzidos pelo homem e seu uso na modelagem de doenças mitocondriais.
Abstract
As doenças mitocondriais representam a maior classe de erros inatos do metabolismo e são atualmente incuráveis. Essas doenças causam defeitos neurodesenvolvimentistas cujos mecanismos subjacentes permanecem a ser elucidados. Um grande obstáculo é a falta de modelos eficazes recapitulando o comprometimento neuronal de início precoce visto nos pacientes. Os avanços na tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) permitem a geração de organoides cerebrais tridimensionais (3D) que podem ser usados para investigar o impacto das doenças no desenvolvimento e organização do sistema nervoso. Pesquisadores, incluindo esses autores, introduziram recentemente organoides cerebrais humanos para modelar distúrbios mitocondriais. Este artigo relata um protocolo detalhado para a geração robusta de organoides cerebrais derivados do iPSC humanos e seu uso em perfis bioenergénicos mitocondrial e análises de imagens. Esses experimentos permitirão o uso de organoides cerebrais para investigar disfunções metabólicas e de desenvolvimento e podem fornecer informações cruciais para dissecar a patologia neuronal de doenças mitocondriais.
Introduction
As doenças mitocondriais representam a maior classe de erros inatos do metabolismo1. São causadas por mutações genéticas que interrompem diferentes processos mitocondriais, incluindo fosforilação oxidativa (OXPHOS)2, montagem da cadeia respiratória, dinâmica mitocondrial e transcrição ou replicação do DNA mitocondrial3. Tecidos com necessidades energéticas são particularmente afetados pela disfunção mitocondrial4. Assim, pacientes com doenças mitocondriais normalmente desenvolvem manifestações neurológicas precoces.
Atualmente, não há tratamentos disponíveis para crianças afetadas com doenças mitocondriais5. Um grande obstáculo para o desenvolvimento de medicamentos de doenças mitocondriais é a falta de modelos eficazes recapitulando o curso da doença humana6. Vários dos modelos animais atualmente estudados não apresentam os defeitos neurológicos presentes nos pacientes7. Assim, os mecanismos subjacentes à patologia neuronal das doenças mitocondriais ainda não são totalmente compreendidos.
Estudos recentes geraram iPSCs de pacientes afetados por doenças mitocondriais e usaram essas células para obter células neuronais específicas do paciente. Por exemplo, defeitos genéticos associados à doença mitocondrial, síndrome de Leigh, foram encontrados para causar aberrações em bioenergética celular8,9, síntese proteica10 e homeostase de cálcio9,11. Esses relatórios forneceram importantes pistas mecanicistas sobre o comprometimento neuronal que ocorre em doenças mitocondriais, abrindo caminho para a descoberta de medicamentos para essas doenças incuráveis12.
Culturas bidimensionais (2D), no entanto, não permitem a investigação da complexidade arquitetônica e da organização regional dos órgãos 3D13. Para isso, o uso de organoides cerebrais 3D derivados de iPSCs 14 específicos do paciente pode permitir que os pesquisadores obtenham informações importantes adicionais e, assim, ajudem a dissecar como as doenças mitocondriais impactam o desenvolvimento e a função do sistema nervoso15. Estudos que empregam organoides cerebrais derivados do IPSC para investigar doenças mitocondriais estão começando a descobrir os componentes neurodesenvolvimentista das doenças mitocondriais.
Organoides medulares portadores de mutações associadas à doença mitocondrial, encefalopatia mitocondrial, acidose láctica e síndrome de episódios semelhantes a acidente vascular cerebral (MELAS), apresentaram neurogênese defeituosa e diferenciação retardada do neurônio motor16. Organoides corticais derivados de pacientes com a doença mitocondrial, síndrome de Leigh, apresentaram tamanho reduzido, defeitos na geração de brotos epiteliais neurais e perda de arquitetura cortical17. Organoides cerebrais de pacientes com síndrome de Leigh mostraram que os defeitos da doença iniciam-se ao nível das células progenitoras neurais, que não podem se comprometer com o metabolismo mitocondrial, causando ramificação neuronal aberrante e morfogênese18. Assim, os progenitores neurais podem representar um alvo terapêutico celular para doenças mitocondriais, e estratégias que promovam sua função mitocondrial podem apoiar o desenvolvimento funcional do sistema nervoso.
O uso de organoides cerebrais pode ajudar a descobrir os componentes neurodesenvolvimentos de doenças mitocondriais. As doenças mitocondriais são consideradas principalmente como neurodegeneração de início precoce5. No entanto, defeitos neurodesenvolvimentais também estão presentes em pacientes afetados por doenças mitocondriais, incluindo atraso no desenvolvimento e comprometimento cognitivo19. Organoides cerebrais específicos do paciente podem ajudar a abordar esses aspectos e elucidar como doenças mitocondriais podem afetar o desenvolvimento cerebral humano. A disfunção mitocondrial também poderia desempenhar um papel patogênico em outras doenças neurológicas mais comuns, como a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson e a doença de Huntington4. Assim, elucidar o impacto dos defeitos mitocondriais no neurodesenvolvimento usando organoides cerebrais também pode ser fundamental para o estudo dessas doenças. Este artigo descreve um protocolo detalhado para a geração de organoides cerebrais reprodutíveis que podem ser usados para a condução da modelagem de doenças mitocondriais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo descreve a geração reprodutível de organoides cerebrais derivados do iPSC humanos e seu uso para modelagem de doenças mitocondriais. O protocolo descrito aqui é modificado com base em um trabalho publicado anteriormente20. Uma grande vantagem do presente protocolo é que ele não requer a incorporação manual de cada organoide em uma matriz de andaimes. Na verdade, a solução matricial é simplesmente dissolvida no meio da cultura celular. Além disso, não há necessidade de em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Miriam Bünning pelo apoio técnico. Reconhecemos o apoio da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 a A.P.), Spark e Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), the United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD to A.P.), e o Ministério Federal alemão de Educação e Pesquisa (BMBF) (e: Bio jovem investigador conceder AZ 031L0211 a A.P.). O trabalho no laboratório da C.R.R. foi apoiado pelo DFG (FOR 2795 “Sinapses sob estresse”, Ro 2327/13-1).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
| Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
| Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
| Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
| Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Sodium chloride | Roth | 3957 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
References
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