Генерация органоидов головного мозга человека для моделирования митохондриальных заболеваний
Summary
Мы описываем подробный протокол генерации индуцированных человеком плюрипотентных органоидов мозга, полученных из стволовых клеток, и их использование в моделировании митохондриальных заболеваний.
Abstract
Митохондриальные заболевания представляют собой самый большой класс врожденных ошибок метаболизма и в настоящее время неизлечимы. Эти заболевания вызывают дефекты развития нервной системы, основные механизмы которых еще предстоит выяснить. Основным препятствием является отсутствие эффективных моделей, повторяющих раннее нарушение нейронов, наблюдаемое у пациентов. Достижения в технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSCs) позволяют генерировать трехмерные (3D) органоиды мозга, которые могут быть использованы для исследования влияния заболеваний на развитие и организацию нервной системы. Исследователи, в том числе эти авторы, недавно представили органоиды человеческого мозга для моделирования митохондриальных расстройств. В этой статье сообщается о подробном протоколе для надежной генерации органоидов головного мозга человека, полученных из iPSC, и их использовании в митохондриальном биоэнергетическом профилировании и анализе изображений. Эти эксперименты позволят использовать органоиды мозга для исследования метаболических дисфункций и дисфункций развития и могут предоставить важную информацию для препарирования нейронной патологии митохондриальных заболеваний.
Introduction
Митохондриальные заболевания представляют собой самый большой класс врожденных ошибок метаболизма1. Они вызваны генетическими мутациями, нарушающими различные митохондриальные процессы, включая окислительное фосфорилирование (OXPHOS)2, сборку дыхательной цепи, митохондриальную динамику и транскрипцию или репликацию митохондриальной ДНК3. Ткани с энергетическими потребностями особенно страдают от митохондриальной дисфункции4. Соответственно, у пациентов с митохондриальными заболеваниями обычно развиваются ранние неврологические проявления.
В настоящее время нет доступных методов лечения для детей, страдающих митохондриальными заболеваниями5. Основным препятствием для разработки лекарств от митохондриальных заболеваний является отсутствие эффективных моделей, повторяющих течение болезни человека6. Некоторые из изученных в настоящее время животных моделей не демонстрируют неврологических дефектов, присутствующих у пациентов7. Следовательно, механизмы, лежащие в основе нейронной патологии митохондриальных заболеваний, до сих пор не до конца поняты.
Недавние исследования генерировали ИПСК у пациентов, страдающих митохондриальными заболеваниями, и использовали эти клетки для получения специфических для пациента нейрональных клеток. Например, было обнаружено, что генетические дефекты, связанные с митохондриальным заболеванием, синдромом Ли, вызывают аберрации в клеточной биоэнергетике8,9, синтезе белка10 и гомеостазе кальция9,11. Эти отчеты предоставили важные механистические подсказки о нарушениях нейронов, происходящих при митохондриальных заболеваниях, проложив путь к открытию лекарств для этих неизлечимых заболеваний12.
Двумерные (2D) культуры, однако, не позволяют исследовать архитектурную сложность и региональную организацию 3D-органов13. С этой целью использование 3D-органоидов мозга, полученных из специфических для пациента iPSCs14, может позволить исследователям получить дополнительную важную информацию и тем самым помочь проанализировать, как митохондриальные заболевания влияют на развитие и функцию нервной системы15. Исследования с использованием органоидов головного мозга, полученных из iPSC, для изучения митохондриальных заболеваний начинают раскрывать компоненты развития нервной системы митохондриальных заболеваний.
Органоиды спинного мозга, несущие мутации, связанные с митохондриальным заболеванием, митохондриальной энцефалопатией, лактоацидозом и синдромом инсультоподобных эпизодов (MELAS), показали дефектный нейрогенез и задержку дифференцировки двигательных нейронов16. Корковые органоиды, полученные от пациентов с митохондриальным заболеванием, синдромом Ли, показали уменьшенные размеры, дефекты генерации нервных эпителиальных почек и потерю корковой архитектуры17. Органоиды головного мозга у пациентов с синдромом Ли показали, что дефекты заболевания инициируются на уровне нейронных клеток-предшественников, которые не могут фиксировать митохондриальный метаболизм, вызывая аберрантное ветвление нейронов и морфогенез18. Таким образом, нейронные предшественники могут представлять собой клеточную терапевтическую мишень для митохондриальных заболеваний, а стратегии, способствующие их митохондриальной функции, могут поддерживать функциональное развитие нервной системы.
Использование органоидов мозга может помочь раскрыть компоненты нейроразвития митохондриальных заболеваний. Митохондриальные заболевания в основном рассматриваются как раннее начало нейродегенерации5. Однако дефекты развития нервной системы также присутствуют у пациентов, страдающих митохондриальными заболеваниями, включая задержку развития и когнитивные нарушения19. Органоиды мозга, специфичные для пациента, могут помочь решить эти аспекты и прояснить, как митохондриальные заболевания могут влиять на развитие мозга человека. Митохондриальная дисфункция может также играть патогенетическую роль в других более распространенных неврологических заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона4. Следовательно, выяснение влияния митохондриальных дефектов на нервное развитие с использованием органоидов мозга также может сыграть важную роль в изучении этих заболеваний. В этой статье описывается подробный протокол генерации воспроизводимых органоидов головного мозга, которые могут быть использованы для проведения моделирования заболеваний митохондрий.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье описывается воспроизводимая генерация органоидов головного мозга человека, полученных из iPSC, и их использование для моделирования митохондриальных заболеваний. Протокол, описанный здесь, модифицирован на основе ранее опубликованной работы20. Одним из основ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Благодарим Мириам Бюннинг за техническую поддержку. Мы признаем поддержку со стороны Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 to A.P.), Spark и Берлинского института здравоохранения (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), Объединенного фонда митохондриальных заболеваний (UMDF) (грант Международного консорциума синдрома Ли для A.P.), Университетской больницы Дюссельдорфа (Forschungskommission UKD to A.P.) и Федерального министерства образования и исследований Германии (BMBF) (e: Грант био молодого исследователя AZ 031L0211 для A.P.). Работа в лаборатории C.R.R. была поддержана DFG (ЗА 2795 «Синапсы в состоянии стресса», Ro 2327/13-1).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
| Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
| Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
| Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
| Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Sodium chloride | Roth | 3957 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
References
- Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080 (2016).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
- Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
- Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
- Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
- Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
- Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).
- Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378 (2016).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
- Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
- Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).
- Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
- Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).
- Falk, M. J. Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease. Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
- Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).
- Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760 (2020).
- Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
