Generación de organoides cerebrales humanos para el modelado de enfermedades mitocondriales
Summary
Describimos un protocolo detallado para la generación de organoides cerebrales derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos y su uso en el modelado de enfermedades mitocondriales.
Abstract
Las enfermedades mitocondriales representan la clase más grande de errores congénitos del metabolismo y actualmente son incurables. Estas enfermedades causan defectos del neurodesarrollo cuyos mecanismos subyacentes aún no se han dilucidado. Un obstáculo importante es la falta de modelos efectivos que recapitulen el deterioro neuronal de inicio temprano observado en los pacientes. Los avances en la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) permiten la generación de organoides cerebrales tridimensionales (3D) que se pueden utilizar para investigar el impacto de las enfermedades en el desarrollo y la organización del sistema nervioso. Los investigadores, incluidos estos autores, han introducido recientemente organoides cerebrales humanos para modelar trastornos mitocondriales. Este artículo informa un protocolo detallado para la generación robusta de organoides cerebrales derivados de iPSC humanos y su uso en perfiles bioenergéticos mitocondriales y análisis de imágenes. Estos experimentos permitirán el uso de organoides cerebrales para investigar disfunciones metabólicas y de desarrollo y pueden proporcionar información crucial para diseccionar la patología neuronal de las enfermedades mitocondriales.
Introduction
Las enfermedades mitocondriales representan la mayor clase de errores congénitos del metabolismo1. Son causadas por mutaciones genéticas que interrumpen diferentes procesos mitocondriales, incluyendo la fosforilación oxidativa (OXPHOS)2, el ensamblaje de la cadena respiratoria, la dinámica mitocondrial y la transcripción o replicación del ADN mitocondrial3. Los tejidos con requerimientos energéticos se ven particularmente afectados por la disfunción mitocondrial4. En consecuencia, los pacientes con enfermedades mitocondriales suelen desarrollar manifestaciones neurológicas de inicio temprano.
Actualmente no existen tratamientos disponibles para los niños afectados con enfermedades mitocondriales5. Un obstáculo importante para el desarrollo farmacológico de enfermedades mitocondriales es la falta de modelos efectivos que recapitulen el curso de la enfermedad humana6. Varios de los modelos animales actualmente estudiados no presentan los defectos neurológicos presentes en los pacientes7. Por lo tanto, los mecanismos subyacentes a la patología neuronal de las enfermedades mitocondriales aún no se comprenden completamente.
Estudios recientes generaron iPSCs de pacientes afectados por enfermedades mitocondriales y utilizaron estas células para obtener células neuronales específicas del paciente. Por ejemplo, se ha encontrado que los defectos genéticos asociados a la enfermedad mitocondrial, el síndrome de Leigh, causan aberraciones en la bioenergética celular8,9, la síntesis de proteínas10 y la homeostasis del calcio9,11. Estos informes proporcionaron importantes pistas mecanicistas sobre el deterioro neuronal que ocurre en las enfermedades mitocondriales, allanando el camino para el descubrimiento de fármacos para estas enfermedades incurables12.
Las culturas bidimensionales (2D), sin embargo, no permiten la investigación de la complejidad arquitectónica y la organización regional de los órganos 3D13. Con este fin, el uso de organoides cerebrales 3D derivados de iPSCs específicas del paciente14 puede permitir a los investigadores obtener información adicional importante y, por lo tanto, ayudar a diseccionar cómo las enfermedades mitocondriales afectan el desarrollo y la función del sistema nervioso15. Los estudios que emplean organoides cerebrales derivados de iPSC para investigar enfermedades mitocondriales están comenzando a descubrir los componentes del neurodesarrollo de las enfermedades mitocondriales.
Los organoides de la médula espinal portadores de mutaciones asociadas con la enfermedad mitocondrial, la encefalopatía mitocondrial, la acidosis láctica y el síndrome de episodios similares a accidentes cerebrovasculares (MELAS), mostraron neurogénesis defectuosa y diferenciación retardada de la neurona motora16. Los organoides corticales derivados de pacientes con enfermedad mitocondrial, síndrome de Leigh, mostraron reducción de tamaño, defectos en la generación de brotes epiteliales neurales y pérdida de la arquitectura cortical17. Los organoides cerebrales de pacientes con síndrome de Leigh demostraron que los defectos de la enfermedad se inician a nivel de las células progenitoras neurales, que no pueden comprometerse con el metabolismo mitocondrial, causando ramificación neuronal aberrante y morfogénesis18. Por lo tanto, los progenitores neurales pueden representar un objetivo terapéutico celular para las enfermedades mitocondriales, y las estrategias que promueven su función mitocondrial pueden apoyar el desarrollo funcional del sistema nervioso.
El uso de organoides cerebrales podría ayudar a descubrir los componentes del neurodesarrollo de las enfermedades mitocondriales. Las enfermedades mitocondriales se consideran principalmente como neurodegeneración de inicio temprano5. Sin embargo, los defectos del neurodesarrollo también están presentes en pacientes afectados por enfermedades mitocondriales, incluyendo retraso en el desarrollo y deterioro cognitivo19. Los organoides cerebrales específicos del paciente pueden ayudar a abordar estos aspectos y dilucidar cómo las enfermedades mitocondriales pueden afectar el desarrollo del cerebro humano. La disfunción mitocondrial también podría desempeñar un papel patogénico en otras enfermedades neurológicas más comunes, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington4. Por lo tanto, dilucidar el impacto de los defectos mitocondriales en el neurodesarrollo utilizando organoides cerebrales también podría ser fundamental para el estudio de esas enfermedades. Este artículo describe un protocolo detallado para generar organoides cerebrales reproducibles que se pueden utilizar para realizar modelos de enfermedades mitocondriales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo describe la generación reproducible de organoides cerebrales derivados de iPSC humanos y su uso para el modelado de enfermedades mitocondriales. El protocolo aquí descrito se modifica en base a un trabajo publicado previamente20. Una ventaja importante del protocolo actual es que no requiere la incrustación manual de cada organoide en una matriz de andamios. De hecho, la solución matricial simplemente se disuelve en el medio de cultivo celular. Además, no hay necesidad de emple…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Miriam Bünning por su apoyo técnico. Agradecemos el apoyo de deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 a A.P.), Spark y berlinesa Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), la United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD to A.P.), y el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (BMBF) (e: Bio joven investigador concede AZ 031L0211 a A.P.). El trabajo en el laboratorio de C.R.R. fue apoyado por el DFG (FOR 2795 “Sinapsis bajo estrés”, Ro 2327/13-1).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
| Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
| Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
| Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
| Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Sodium chloride | Roth | 3957 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
References
- Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080 (2016).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
- Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
- Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
- Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
- Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
- Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).
- Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378 (2016).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
- Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
- Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).
- Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
- Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).
- Falk, M. J. Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease. Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
- Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).
- Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760 (2020).
- Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
