Generering av humane hjerneorganoider for mitokondriesykdomsmodellering
Summary
Vi beskriver en detaljert protokoll for generering av menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede hjerneorganoider og deres bruk i modellering av mitokondriesykdommer.
Abstract
Mitokondriesykdommer representerer den største klassen av medfødte feil i metabolismen og er for tiden uhelbredelig. Disse sykdommene forårsaker nevrodevelopmentale defekter hvis underliggende mekanismer gjenstår å bli belyst. En stor veisperring er mangelen på effektive modeller som rekapitlerer tidlig nevronsvikt sett hos pasientene. Fremskritt i teknologien for induserte pluripotente stamceller (iPSCer) muliggjør generering av tredimensjonale (3D) hjerneorganoider som kan brukes til å undersøke virkningen av sykdommer på utvikling og organisering av nervesystemet. Forskere, inkludert disse forfatterne, har nylig introdusert menneskelige hjerneorganoider for å modellere mitokondrieforstyrrelser. Denne artikkelen rapporterer en detaljert protokoll for robust generering av humane iPSC-avledede hjerneorganoider og deres bruk i mitokondriebioenergetiske profilerings- og bildeanalyser. Disse forsøkene vil tillate bruk av hjerneorganoider for å undersøke metabolske og utviklingsmessige dysfunksjoner og kan gi avgjørende informasjon for å dissekere nevronpatologien til mitokondriesykdommer.
Introduction
Mitokondriesykdommer representerer den største klassen av medfødte feil i metabolismen1. De er forårsaket av genetiske mutasjoner som forstyrrer forskjellige mitokondrieprosesser, inkludert oksidativ fosforylering (OXPHOS)2, respiratorisk kjedemontering, mitokondriedynamikk og mitokondrie-DNA-transkripsjon eller replikering3. Vev med energibehov påvirkes spesielt av mitokondrie dysfunksjon4. Følgelig utvikler pasienter med mitokondriesykdommer vanligvis tidlige nevrologiske manifestasjoner.
Det finnes for tiden ingen behandlinger tilgjengelig for barn som er rammet av mitokondriesykdommer5. En stor hindring for legemiddelutvikling av mitokondriesykdommer er mangelen på effektive modeller som rekapitlerer det menneskelige sykdomsforløpet6. Flere av de for tiden studerte dyremodellene viser ikke de nevrologiske feilene som finnes hos pasientene7. Derfor er mekanismene som ligger til grunn for nevronpatologien til mitokondriesykdommer fortsatt ikke fullt ut forstått.
Nyere studier genererte iPSCer fra pasienter som er rammet av mitokondriesykdommer og brukte disse cellene til å skaffe pasientspesifikke nevronceller. For eksempel har genetiske defekter forbundet med mitokondriesykdommen, Leigh syndrom, vist seg å forårsake avvik i cellulær bioenergi 8,9, proteinsyntese10 og kalsium homeostase9,11. Disse rapportene ga viktige mekanistiske ledetråder om nevronnedsettelsen som forekommer i mitokondriesykdommer, og banet vei for narkotikaoppdagelse for disse uhelbredelige sykdommene12.
Todimensjonale (2D) kulturer muliggjør imidlertid ikke undersøkelse av den arkitektoniske kompleksiteten og den regionale organiseringen av 3D-organer13. For dette formål kan bruk av 3D-hjerneorganoider avledet fra pasientspesifikke iPSCer14 tillate forskere å få ytterligere viktig informasjon og dermed bidra til å dissekere hvordan mitokondriesykdommer påvirker utviklingen og funksjonen til nervesystemet15. Studier som bruker iPSC-avledede hjerneorganoider for å undersøke mitokondriesykdommer begynner å avdekke nevrodevelopmentale komponenter av mitokondriesykdommer.
Ryggmargsorganoider som bærer mutasjoner forbundet med mitokondriesykdommen, mitokondrie encefalopati, melkesyreose og slaglignende episoder syndrom (MELAS), viste defekt nevrogenese og forsinket motorisk nevrondifferensiering16. Kortikale organoider avledet fra pasienter med mitokondriesykdommen, Leigh syndrom, viste redusert størrelse, defekter i nevral epitelial knoppgenerering og tap av kortikale arkitektur17. Hjerneorganoider fra Leighs syndrompasienter viste at sykdomsfeilene initierer på nivået av nevrale stamceller, som ikke kan forplikte seg til mitokondriemetabolisme, forårsaker avvikende nevronal forgrening og morfogenese18. Dermed kan nevrale forfedre representere et cellulært terapeutisk mål for mitokondriesykdommer, og strategier som fremmer deres mitokondriefunksjon kan støtte den funksjonelle utviklingen av nervesystemet.
Bruken av hjerneorganoider kan bidra til å avdekke nevrodevelopmentale komponenter av mitokondriesykdommer. Mitokondriesykdommer anses hovedsakelig som tidlig nevrodegenerasjon5. Imidlertid er nevrodevelopmentale defekter også til stede hos pasienter som er rammet av mitokondriesykdommer, inkludert utviklingsforsinkelse og kognitiv svikt19. Pasientspesifikke hjerneorganoider kan bidra til å adressere disse aspektene og belyse hvordan mitokondriesykdommer kan påvirke menneskelig hjerneutvikling. Mitokondrie dysfunksjon kan også spille en patogenetisk rolle i andre mer vanlige nevrologiske sykdommer, som Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom og Huntington sykdom4. Derfor kan det å belyse virkningen av mitokondriefeil i nevroutvikling ved hjelp av hjerneorganoider også være avgjørende for studiet av disse sykdommene. Dette dokumentet beskriver en detaljert protokoll for å generere reproduserbare hjerneorganoider som kan brukes til å utføre sykdomsmodellering av mitokondriesykdommer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette dokumentet beskriver den reproduserbare generasjonen av humane iPSC-avledede hjerneorganoider og deres bruk for mitokondriesykdomsmodellering. Protokollen som er beskrevet her, endres basert på et tidligere publisert arbeid20. En stor fordel med den nåværende protokollen er at den ikke krever manuell innebygging av hvert organoid i en stillasmatrise. Faktisk er matriseløsningen ganske enkelt oppløst i cellekulturmediet. Videre er det ikke nødvendig å bruke dyre bioreaktorer, da organo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Miriam Bünning for teknisk støtte. Vi anerkjenner støtte fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 til A.P.), Spark and Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD til A.P.), og det tyske føderale utdannings- og forskningsdepartementet (BMBF) (e: Bio ung etterforsker gi AZ 031L0211 til A.P.). Arbeidet i laboratoriet til C.R.R. ble støttet av DFG (FOR 2795 “Synapses under stress”, Ro 2327/13-1).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
| Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
| Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
| Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
| Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Sodium chloride | Roth | 3957 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
References
- Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080 (2016).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
- Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
- Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
- Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
- Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
- Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).
- Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378 (2016).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
- Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
- Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).
- Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
- Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).
- Falk, M. J. Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease. Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
- Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).
- Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760 (2020).
- Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
