관심 조직/기관 및 피부에 직접 접착할 수 있는 광학적으로 투명한 실리콘 창을 사용하여 장기간 생체 내 이미징을 위한 접근법이 제시됩니다. 이 창문은 현재 현장에서 사용되는 다른 창문보다 저렴하고 다재다능하며 외과 적 삽입은 동물에게 제한된 염증과 고통을 유발합니다.
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방법 논문
투명한 실리콘 윈도우를 통한 종방향 생체 내 이미징
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이 논문에서
요약
초록
생체 내 현미경 검사 (IVM)는 단일 세포 분해능에서 세포 이동, 분열 및 사망의 시각화를 가능하게합니다. 외과적으로 삽입된 이미징 윈도우를 통한 IVM은 수일 내지 수주에 걸쳐 동일한 조직의 종방향 관찰을 허용하기 때문에 특히 강력하다. 일반적인 이미징 창은 마우스의 피부에 봉합된 생체적합성 금속 프레임의 유리 커버슬립을 포함한다. 이 창문은 생쥐의 자유로운 움직임을 방해하고 강한 염증 반응을 이끌어 낼 수 있으며 깨진 유리 또는 찢어진 봉합사로 인해 실패 할 수 있으며 그 중 어느 것도 안락사가 필요할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 장기 복부 장기 및 유선 이미징을위한 창문은 이전에 두개골 이미징 창에 사용 된 광학적으로 투명한 실리콘 폴리머 인 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)의 박막으로 개발되었습니다. 이 창문은 조직에 직접 접착 할 수있어 삽입에 필요한 시간을 줄일 수 있습니다. PDMS는 유연하여 시간이 지남에 따라 마우스의 내구성에 기여하며 최대 35 일이 테스트되었습니다. 종방향 영상화는 개별 세션 동안 동일한 조직 영역의 영상화이다. 스테인리스 스틸 그리드가 창문 내에 내장되어 동일한 지역을 현지화하여 며칠 간격으로 동일한 위치에서 동적 프로세스 (예 : 유선의 개입)를 시각화 할 수있었습니다. 이 실리콘 창은 또한 시간이 지남에 따라 미세 전이로 발전하는 단일 전파 암 세포를 모니터링 할 수있었습니다. 이 연구에 사용 된 실리콘 창은 금속 프레임 유리 창보다 삽입하기가 간단하며 이미지 된 조직의 제한된 염증을 일으 킵니다. 또한, 임베디드 그리드는 반복 이미징 세션에서 동일한 조직 영역의 간단한 추적을 허용합니다.
서론
마취 된 동물의 조직 이미징 인 Intravital Microscopy (IVM)는 손상되지 않은 조직에서 세포 분해능에서 생리 학적 및 병리학 적 사건의 역학에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 기술의 적용은 매우 다양하지만 IVM은 암 생물학 분야에서 암세포가 조직을 침범하고 전이하는 방법을 밝히고 주변 미세 환경과 상호 작용하며 약물 1,2,3에 반응하는 데 도움이되었습니다. 또한, IVM은 생체외 프로파일링 접근법(예를 들어, 유세포 분석기)에 상보적인 통찰을 제공함으로써 면역 반응을 지배하는 복잡한 메카니즘의 이해를 증진시키는 열쇠가 되었다. 예를 들어, 생체 내 영상 실험은 세포 이동 및 세포 - 세포 접촉과 관련된 면역 기능에 대한 세부 사항을 밝혀 냈으며 부상이나 감염에 대한 반응으로 시공간 역학을 정량화하는 플랫폼을 제공했습니다 4,5,6,7. 이러한 과정의 대부분은 조....
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프로토콜
설명 된 모든 절차는 콜드 스프링 하버 실험실 외과 지침에 따라 수행되었으며 콜드 스프링 하버 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
1. 실리콘 창 주조
- 베이스 엘라스토머와 경화제를 10:1 (v/v) 비율로 혼합하여 실리콘 폴리머(PDMS)를 준비합니다.
- 멸균되고 매끄러운 표면에 소량의 PDMS를 증착하여 창을 캐스팅하고 부피 대 면적비를 원하는 두께로 조정한다.
참고: 24웰 플레이트 뚜껑의 뚜껑에 직경 22mm 원형에 200mg의 폴리머 용액을 사용하면 창의 견고성과 광학 선명도 간에 좋은 절충안이 나타납니다. - 옵션: 동일한 조직 영역의 반복 이미징을 위한 랜드마크를 제공하려면 PDMS가 원하는 주조 표면에 있는 후 실리콘으로 스테인리스 스틸 그리드를 가볍게 누릅니다.
- 기포를 제거하려면 코팅된 표면을 진공 데시케이터에 45분 동안 놓고 폴리머를 탈기시킨다.
- 실리콘 창문을 80°C의 오븐에서 45분 동안 경화시킨다.
- 금형의 가장자리에서 폴리머를 스코어링하고 포셉으로 주조하는 데 사용되는 표면에서 경화 된 창을 부드럽게 벗겨냅니다.
- 수술 전에 오토클레이빙으로....
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결과
이미징 창을 통한 생체 내 이미징은 몇 시간에서 몇 주에 걸쳐 단일 세포 분해능에서 광범위한 세포 및 분자 사건을 관찰, 추적 및 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이미징 윈도우에 이상적인 특징은 다음을 포함한다: a) 마우스의 웰빙 및 조직의 생리학에 대한 제한된 영향; b) 내구성; c) 삽입의 단순성; d) 동일한 영역의 반복 이미징을위한 명확한 랜드 마크. 그 결과 다용도의 불활성 실리콘 윈도우가 탄생하여 쉽게 제작되고 삽입되며, 여러 이미징 세션의 범위에 걸쳐 동일한 시야각을 찾을 수 있는 그리드를 장착할 수 있습니다.
창은 저렴하고 유연하며 명확한 재료 인 PDMS로 만들어졌습니다. Windows는 대부분의 실험실에서 구입할 수있는 소모품으로 주조 할 수 있습니다. 이러한 목적을 위해, 상업적으로 입수가능한 24개의 웰 플레이트의 뚜껑에 이미 에칭된 원형 몰드(직경 22mm)가 잘 작동합니다. 단위 면적당 사용되는 폴리머의 양을 변화시킴으로써, 윈도우의 두께를 조절할.......
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토론
Intravital 이미징 창은 시간이 지남에 따라 펼쳐지는 세포 분해능에서 생리 학적 및 병리학 적 과정을 직접 시각화하는 데 중요한 도구입니다. 마우스에 유연한 실리콘 이미징 창을 주조 및 삽입하기 위해 설명 된 새로운 절차는 현재 사용되는 이미징 창 (삼출, 파손 및 정상적인 이동성과의 간섭)의 가장 일반적인 문제 중 일부를 극복하고 마우스에 대한 추가 안전성을 제공하며이 기술의 접근성을 향상시킵니다.
가장 널리 사용되는 이미징 창은 유리 커버 슬립을 고정하는 금속 프레임으로 구성됩니다. 이러한 프로토 타입 창문의 사용에 대한 주요 장애물은 금속 링을 고정하는 것이 힘든 스티칭 절차를 필요로하므로 고급 외과 적 훈련을 받아야한다는 것입니다. 또한 프레임을 제조하는 데 비용이 많이 들고 특수 장비가 필요합니다. PDMS 창은 이러한 두 가지 문제를 모두 극복합니다. PDMS 창을 삽입하는 절차는 바느질을 제거하여 기술 학습에 대한 장벽을 크게 낮춥니다. 창문을 생산하는 재료도.......
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공개 사항
M.E.는 Insmed, Inc.의 brensocatib 연구 자문위원회 위원입니다. Vividion Therapeutics, Inc.의 과학 자문위원회 위원; Protalix, Inc.의 컨설턴트; Agios Pharmaceuticals, Inc. D.A.T.는 Mestag Therapeutics의 공동 설립자이며 과학 자문위원회에 소속되어 있으며 Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology 및 Cygnal Therapeutics의 지분을 보유하고 있습니다. 다른 저자들은 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
레이저 컷 스테인레스 스틸 그리드를 설계하고 최적화하는 데 도움을 주신 Rob Eifert에게 감사드립니다. 이 연구는 CSHL 암 센터 (P30-CA045508)와 국립 보건원 (NIH)의 M.E. 기금 (1R01CA2374135 및 5P01CA013106-49)에 의해 지원되었습니다. CSHL 및 노스웰 헬스; 톰슨 가족 재단; 미국 전역에서 수영; Simons Foundation에서 CSHL에 대한 보조금. M.S.는 국립 일반 의료 과학 연구소 의료 과학자 교육 프로그램 교육 상 (T32-GM008444)과 NIH의 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)의 수상 번호 1F30CA253993-01의 지원을 받았습니다. L.M.은 James S. McDonnell Foundation Postdoctoral Fellowship의 지원을 받습니다. J.M.A.는 암 연구소 / 어빙턴 박사 후 펠로우십 (CRI 상 # 3435)을 수상했습니다. D.A.T.는 Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research 및 Thompson Family Foundation의 지원을 받습니다. 만화는 Biorender.com 로 만들어졌습니다.
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| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR 마이크로 커버 유리 | VWR | 48404-453 |
참고문헌
- Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
- Haeger, A., et al.
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