使用同质珠为基础的检测的查佩龙-科查佩龙相互作用研究
Summary
该协议提出了一种利用谷胱甘肽相关的供体珠与 GST 融合的 TPR-motif 共同伴奏和接受珠以及 Hsp90 衍生肽来探索蛋白质- 蛋白质相互作用的技术。我们使用此技术筛选小分子，以破坏 Hsp90-FKBP51 或 Hsp90-FKBP52 相互作用，并识别出有效和选择性的 Hsp90-FKBP51 相互作用抑制剂。
Abstract
针对热休克蛋白 90 （Hsp90） – 可可酮相互作用提供了专门调节 Hsp90 依赖细胞内过程的可能性。Hsp90 C 终点站保存的 MEEVD 五肽负责与共护的四肽重复 （TPR） 主题的相互作用。FK506 结合蛋白 （FKBP） 51 和 FKBP52 是两个类似的 TPR 主题共同伴奏涉及类固醇激素依赖性疾病具有不同的功能.因此，识别专门阻断Hsp90和FKBP51或FKBP52之间相互作用的分子为几种人类疾病提供了有希望的治疗潜力。在这里，我们描述了放大发光接近同质测定程序，以调查Hsp90与其合作伙伴FKBP51和FKBP52之间的相互作用。首先，我们以谷胱甘肽S转移酶（GST）标记形式纯化了含TPR图案的蛋白质FKBP51和FKBP52。利用与谷胱甘肽相关的供体珠与 GST 融合的 TPR-motif 蛋白和接受珠，以及 Hsp90 的 10 mer C 终端肽，我们探索了同质环境中的蛋白质-蛋白质相互作用。我们利用此检测屏蔽小分子，以破坏 Hsp90-FKBP51 或 Hsp90-FKBP52 相互作用，并识别出有效和选择性的 Hsp90-FKBP51 相互作用抑制剂。
Introduction
分子伴奏有助于蛋白质平衡，包括蛋白质折叠、运输和降解。它们调节几个细胞过程，与许多疾病有关，如癌症和神经退行性疾病1。热休克蛋白90（Hsp90）是最重要的伴奏之一，其功能取决于ATP水解驱动的构象变化，并与由其共同伴奏2调解的客户蛋白结合。尽管Hsp90作为治疗靶点的潜力显而易见，但微调其功能是一个很大的挑战。有几个Hsp90抑制剂针对N终端ATP结合区，已在临床试验中评估，但没有一个已被批准营销3。由于缺乏一个明确的配体绑定口袋4，针对Hsp90的C终端区域已经取得了有限的成功4。最近，小分子对Hsp90-cochaperone相互作用的破坏被作为替代策略5进行了研究。以Hsp90-cochaperone相互作用为目标不会引起一般细胞应激反应，并有可能具体调节各种细胞内过程。Hsp90 C 终点站保存的 MEEVD 五肽负责与共伴6的四肽重复 （TPR） 主题的相互作用。在人类蛋白质数据库中注释的736种TPR主题含图案的蛋白质中，有20种不同的蛋白质通过这种肽7与Hsp90相互作用。分子争夺MEEVD肽结合会破坏Hsp90和含有TPR域的共同伴奏之间的相互作用。肽结合场具有类似的第三级结构，但不同TPR主题域之间的整体同源性相对较低，提供了一个机会来识别分子，特别是能够阻止Hsp90和特定TPR-主题共同伴奏之间的相互作用。在这些TPR-motif共同伴奏中，FK506结合蛋白（FKBP）51和FKBP52是类固醇激素受体（SHR）信号的调节器，并涉及多种类固醇激素依赖性疾病，包括癌症、压力相关疾病、代谢疾病和阿尔茨海默氏症8。虽然FKBP51和FKBP52的份额>80%的序列相似性，但它们的功能不同：FKBP52是SHR活动的正调节器，而FKBP51在大多数情况下是负监管机构。因此，识别分子，特别是阻断Hsp90和FKBP51或FKBP52之间的相互作用，为相关疾病提供了有希望的治疗潜力。
1994年，乌尔曼EF等人首次研制出一种Mpl化L微生P生源性Asay（阿尔法屏幕）。现在，它被广泛用于检测不同类型的生物相互作用，如肽10，蛋白质11，DNA12，RNA13和糖14。在这项技术中，有两种珠子（直径200纳米），一种是捐赠珠，另一种是接受珠。生物分子固定在这些珠子上;他们的生物相互作用使捐赠者和接受者珠子接近。在680纳米处，捐赠珠中的光敏剂照亮并转换氧气为单氧。由于单氧寿命短，只能扩散至200纳米。如果接受珠在附近，其硫氧生成物与在370纳米下产生化疗的单氧发生反应。这种能量进一步激活荧光灯在同一接受珠发出光在520-620纳米15。如果生物相互作用中断，接受珠和供体珠无法接近，导致单氧衰变和低生成信号。
在这里，我们描述了使用这种技术筛选小分子，抑制Hsp90和TPR共同伴奏之间的相互作用的协议，特别是FKBP51和FKBP52。与Hsp90极端C终点站对应的10种氨基酸长肽附着在接受珠上。纯化 Gst 标记的 Tpr 共同伴奏与谷胱甘肽相关的捐赠珠子相互作用。当Hsp90衍生肽和TPR-motif共同伴奏器之间的相互作用将珠子聚集在一起时，就会产生放大信号（图1A）。如果筛选的小分子可以抑制Hsp90和TPR-主题共同伴奏之间的相互作用，这个放大的信号将减少（图1B）。他们的IC50 可以通过定量测量来计算。此协议可以扩展到任何伴奏 – TPR-motif 共同伴奏相互作用的兴趣，并在新分子的发展中非常重要，特别是阻止Hsp90和FKBP51或FKBP52之间的相互作用。
图1：本检测的基本原则。（A） 纯化GST-FKBP51与谷胱甘肽相关的捐赠珠子相互作用。与Hsp90极端C终点相对应的10种氨基酸长肽附着在接受珠上。Hsp90 衍生肽和 FKBP51 的 TPR 域之间的相互作用使捐赠者和接受者珠子接近。在680纳米处，捐赠珠中的光敏剂照亮并转换氧气为单氧。接受珠上的硫化物衍生物与单氧发生反应，在 370 nm 处产生化疗。这种能量进一步激活同一接收珠中的荧光，以 520-620 nm 发射光。（B） 当小分子抑制Hsp90和FKBP51之间的相互作用时，供体和接受珠无法接近。然后，寿命短的单氧衰变，并且不产生可检测的信号。请单击此处查看此图的较大版本。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们描述了一个协议，使用检测筛选小分子抑制Hsp90和TPR-motif共同伴奏之间的相互作用，特别是FKBP51和FKBP52。其高 Z 分数（>0.8）显示了高通量格式的坚固性和可靠性。结果可以在一小时内获得，需要少量的珠子、蛋白质和化合物。此外，此协议可以轻松扩展到任何 Hsp90/Hsp70 – TPR-主题共同伴奏感兴趣的相互作用。Hsp90 的几个 TPR-motif 共同伴奏与各种人类疾病有牵连，从阿尔茨海默氏症到自?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了瑞典研究理事会（2018-02843）、大脑基金会（Fo 2019-0140）、卡罗林斯卡研究所老年病基金会、冈沃和约瑟夫·阿尼尔斯基金会、马格努斯·伯格瓦尔斯基金会、冈和伯蒂尔·斯托恩斯基金会、托雷·尼尔森医学研究基金会、玛格丽特·阿夫·乌格拉斯基金会和老仆人基金会的资助。
Materials
| 384-well plates | Perkin Elmer | 6008350 | Assay volume 25 ml |
| Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit | Millipore | UFC901008 | Concentrate protein |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | Antibiotics |
| Bacteria shaker Unimax 1010 | Heidolph | Culture bacteria | |
| cDNA clones for human FKBP51 | Source BioScience | clone id: 5723416 | pCMV-SPORT6 vector |
| cDNA clones for human FKBP52 | Source BioScience | clone id: 7474554 | pCMV-SPORT6 vector |
| Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C602003 | One Shot BL21 Star (DE3) |
| Data analysis software | GraphPad Prism | 9.0.0 | Analysis data and make figures |
| Data analysis software | Excel | Analysis data | |
| DMSO | Supelco | 1.02952.1000 | Dilute compounds |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Prepare solution |
| EDTA | Calbiochem | 344504 | Prevent proteolysis during sonication |
| Glutathione | Sigma | G-4251 | Elute GST-tagged proteins |
| Glutathione donor beads | Perkin Elmer | 6765300 | Donor bead |
| GST-trap column | Cytiva (GE Healthcare) | 17528201 | Purify GST-tagged proteins |
| Isopropyl-β-D-thiogalactoside | Thermo Fisher Scientific | R0392 | Induce protein expression |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | Microbial growth medium |
| PCR instrument | BIO-RAD | S1000 Thermal Cycler | Amplification/PCR |
| PD-10 column | Cytiva (GE Healthcare) | 17085101 | Solution exchange |
| pGEX-6P-1 vector | Cytiva (GE Healthcare) | 28954648 | Plasmid |
| pGEX-6P-2 vector | Cytiva (GE Healthcare) | 28954650 | Plasmid |
| Plate reader | Perkin Elmer | EnSpire 2300 Multilabel Reader | Read alpha plate |
| Plate reader software | Perkin Elmer | EnSpire Manager | Plate reader software |
| Plate reader software protocol | Perkin Elmer | Alpha 384-well Low volume | Use this protocol to read plate |
| PMSF | Sigma | P7626 | Prevent proteolysis during sonication |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | S8830 | Prevent proteolysis during sonication |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | As a preservative |
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma | 156159 | Activates matrix for coupling |
| Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform | Peptide 2.0 inc | Synthesize Hsp90 C-terminal peptide | |
| Test-Tube Rotator | LABINCO | Make end-over-end agitation | |
| Tris-HCl | Sigma | 10708976001 | Block unreacted sites of acceptor beads |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | Prevent beads aggregation |
| Ultra centrifuge Avanti J-20 XP | Beckman Coulter | Centrifuge to get bacteria cell pellets | |
| Ultrasonic cell disruptor | Microson | Sonicate cells to release protein | |
| Unconjugated acceptor beads | Perkin Elmer | 6762003 | Acceptor beads |
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module | Invitrogen | EI0002 | SDS-PAGE |
References
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