Undersøgelser af Chaperone-Cochaperone interaktioner ved hjælp af homogen perle-baseret assay

Summary

Denne protokol præsenterer en teknik til sondering protein-protein interaktioner ved hjælp af glutathion-linked donor perler med GST-fusioneret TPR-motiv co-chaperones og acceptor perler kombineret med en Hsp90-afledt peptid. Vi har brugt denne teknik til at screene små molekyler til at forstyrre Hsp90-FKBP51 eller Hsp90-FKBP52 interaktioner og identificeret potente og selektive Hsp90-FKBP51 interaktionshæmmere.

Abstract

Målretning af varmechokproteinet 90 (Hsp90)-cochaperone-interaktioner giver mulighed for specifikt at regulere Hsp90-afhængige intracellulære processer. Den bevarede MEEVD pentapeptid på C-terminus af Hsp90 er ansvarlig for samspillet med tetratricopeptid repeat (TPR) motiv af co-chaperones. FK506-bindende protein (FKBP) 51 og FKBP52 er to lignende TPR-motiv co-chaperones involveret i steroid hormon-afhængige sygdomme med forskellige funktioner. Derfor giver identifikation af molekyler, der specifikt blokerer interaktioner mellem Hsp90 og FKBP51 eller FKBP52, et lovende terapeutisk potentiale for flere menneskelige sygdomme. Her beskriver vi protokollen for en forstærket selvlysende nærhed homogen analyse til sonde interaktioner mellem Hsp90 og dens partner co-chaperones FKBP51 og FKBP52. For det første har vi renset TPR-motivholdige proteiner FKBP51 og FKBP52 i glutathion S-transferase (GST)-mærket form. Ved hjælp af glutathion-forbundet donor perler med GST-fusioneret TPR-motiv proteiner og acceptor perler kombineret med en 10-mer C-terminal peptid af Hsp90, har vi undersøgt protein-protein interaktioner i et homogent miljø. Vi har brugt denne analyse til at screene små molekyler til at forstyrre Hsp90-FKBP51 eller Hsp90-FKBP52 interaktioner og identificeret potente og selektive Hsp90-FKBP51 interaktionshæmmere.

Introduction

Molekylære chaperoner bidrager til protein homøostase, herunder protein foldning, transport, og nedbrydning. De regulerer flere cellulære processer og er forbundet med mange sygdomme som kræft og neurodegenerative sygdomme¹. Varmechokprotein 90 (Hsp90) er en af de vigtigste chaperoner, hvis funktion er afhængig af kropsbygningsændringer drevet af ATP hydrolyse og binding med klientproteiner medieret af sine co-chaperones². På trods af et indlysende potentiale i Hsp90 som det terapeutiske mål udgør finjustering af dets funktion en stor udfordring. Der er flere Hsp90-hæmmere rettet mod N-terminal ATP-bindingsregionen, som er blevet evalueret i kliniske forsøg, men ingen af dem er godkendt til markedsføring³. På grund af manglen på en veldefineret ligandbindende lomme⁴har målretning mod C-terminal-regionen Hsp90 haft begrænset succes⁴. For nylig er afbrydelse af Hsp90-cochaperone interaktioner med små molekyler blevet undersøgt som en alternativ strategi⁵. Målretning af Hsp90-cochaperone interaktioner ville ikke fremkalde generelle celle stressrespons og giver mulighed for specifikt at regulere forskellige intracellulære processer. Den bevarede MEEVD pentapeptid ved C-terminus af Hsp90 er ansvarlig for samspillet med tetratricopeptid repeat (TPR) motiv af co-chaperones⁶. Af de 736 TPR-motivholdige proteiner, der er kommenteret i humanproteindatabasen, interagerer ~ 20 forskellige proteiner med Hsp90 via dette peptid⁷. Molekyler, der konkurrerer om MEEVD peptidbinding, ville forstyrre samspillet mellem Hsp90 og co-chaperones, der indeholder et TPR-domæne. Peptidbindingsstedet har en lignende tertiær struktur, men den overordnede homologi mellem forskellige TPR-motivdomæner er relativt lav⁷, hvilket giver mulighed for at identificere molekyler, der specifikt er i stand til at blokere interaktioner mellem Hsp90 og bestemte TPR-motiv co-chaperones. Blandt disse TPR-motiv co-chaperones, FK506-bindende protein (FKBP) 51 og FKBP52 er regulatorer af steroid hormon receptor (SHR) signalering og involveret i flere steroid hormon-afhængige sygdomme, herunder kræft, stress-relaterede sygdomme, metaboliske sygdomme, og Alzheimers sygdom⁸. Selvom FKBP51 og FKBP52 deler > 80% sekvenslighed, er deres funktioner forskellige: FKBP52 er en positiv regulator for SHR-aktivitet, mens FKBP51 er en negativ regulator i de fleste tilfælde⁸. Derfor giver identifikation af molekyler, der specifikt blokerer interaktioner mellem Hsp90 og FKBP51 eller FKBP52, et lovende terapeutisk potentiale for relaterede sygdomme.

Enmplified Luminescent Proximity Homogenes Assay (AlphaScreen) blev først udviklet i 1994 af Ullman EF et al.⁹. Nu er det meget udbredt til at opdage forskellige typer af biologiske interaktioner, såsom peptid¹⁰, protein¹¹, DNA^12,RNA^13,og sukker¹⁴. I denne teknik er der to slags perler (diameter 200 nm), den ene er donorperle og den anden er acceptor perlen. Biomolekylerne er immobiliseret på disse perler; deres biologiske interaktioner bringer donor- og acceptorperler i nærheden. Ved 680 nm lyser og omdanner en fotoensibilisator i donorperlen ilt til singlet oxygen. Fordi singlet ilt har en kort levetid, kan det kun diffuse op til 200 nm. Hvis acceptor perlen er i nærheden, dens thioxen derivat reagerer med singlet ilt generere chemiluminescens ved 370 nm. Denne energi aktiverer yderligere fluorophorer i samme accept eller perle til at udsende lys ved 520-620 nm¹⁵. Hvis de biologiske interaktioner afbrydes, kan acceptorperperen og donorperlen ikke nå nærhed, hvilket resulterer i det enkelte iltfald og lavtproducerede signal.

Her beskriver vi en protokol ved hjælp af denne teknik til screening af små molekyler, der hæmmer interaktioner mellem Hsp90 og TPR co-chaperones, især FKBP51 og FKBP52. De 10 aminosyre lange peptider svarende til Hsp90 ekstreme C-endestation er knyttet til acceptor perler. Renset GST-mærkede TPR co-chaperones interagerer med glutathion-linkede donorperler. Når samspillet mellem Hsp90-afledte peptider og TPR-motiv co-chaperones bringer perlerne sammen, produceres et forstærket signal (Figur 1A). Hvis de screenede små molekyler kan hæmme samspillet mellem Hsp90 og TPR-motiv co-chaperones, vil dette forstærkede signal blive reduceret (Figur 1B). Deres IC₅₀ kan beregnes ved kvantitativ måling. Denne protokol kan udvides til enhver chaperone – TPR-motiv co-chaperone interaktioner af interesse og er af stor betydning i udviklingen af nye molekyler, der specifikt blokerer samspillet mellem Hsp90 og FKBP51 eller FKBP52.

Figur 1: Det grundlæggende princip i denne analyse. (A) Renset GST-FKBP51 interagerer med glutathion-linkede donorperler. De 10 aminosyre lange peptider svarende til den ekstreme C-endestation af Hsp90 er knyttet til acceptor perler. Samspillet mellem Hsp90-afledte peptider og TPR domæne FKBP51 bringer donor og acceptor perler i nærheden. Ved 680 nm lyser og omdanner en fotoensibilisator i donorperlen ilt til singlet oxygen. Thioxen-derivatet på acceptorperlen reagerer med singlet oxygen og genererer chemiluminescens ved 370 nm. Denne energi aktiverer yderligere fluorophorer i samme accept eller perle til at udsende lys ved 520-620 nm. (B) Når små molekyler hæmmer samspillet mellem Hsp90 og FKBP51, kan donor- og acceptorperlerne ikke nå nærhed. Derefter henfalder singlet oxygen med kort levetid, og der produceres ikke noget påviseligt signal. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

BEMÆRK: En oversigt over denne protokol findes i figur 2. 1. Udtryk og rensning af GST-FKBP51 og GST-FKBP52 (Figur 2A) PlasmiderBEMÆRK: Få cDNA kloner til menneskelige FKBP51 (klon-id: 5723416) og for menneskelige FKBP52 (klon-id: 7474554) fra IMAGE konsortium. Forstærke det menneskelige FKBP51 DNA af PCR med primere (fremad; 5’GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3′, omvendt; 5′-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCA…

Representative Results

I vores analyse er Z’s faktor og S/B-forhold henholdsvis 0,82 og 13,35 (figur 3A), hvilket viser, at vores analyse er robust og pålidelig til screening med høj kapacitet. Vi brugte det derefter til at screene små molekylære masseforbindelser. Figur 3B præsenterer dosisafhængig hæmning af chaperone-cochaperoneinteraktioner med et udvalgt lille molekyle (D10). Dosis-respons kurverne for D10 genereres ved ikke-lineær regressionsanalyse, baseret på hvilken …

Discussion

Her beskriver vi en protokol ved hjælp af analysen til screening af små molekyler, der hæmmer interaktioner mellem Hsp90 og TPR-motiv co-chaperones, især FKBP51 og FKBP52. Dens høje Z ‘score (>0,8) viser robusthed og pålidelighed for en høj-throughput format. Resultater kan opnås inden for en time, og små mængder af perler, protein og forbindelser er påkrævet. Desuden kan denne protokol let udvides til enhver Hsp90/Hsp70 – TPR-motiv co-chaperone interaktioner af interesse. Flere TPR-motiv co-chaperones af Hsp…

Materials

384-well plates	Perkin Elmer	6008350	Assay volume 25 ml
Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit	Millipore	UFC901008	Concentrate protein
Ampicillin	Sigma	A0166	Antibiotics
Bacteria shaker Unimax 1010	Heidolph		Culture bacteria
cDNA clones for human FKBP51	Source BioScience	clone id: 5723416	pCMV-SPORT6 vector
cDNA clones for human FKBP52	Source BioScience	clone id: 7474554	pCMV-SPORT6 vector
Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C602003	One Shot BL21 Star (DE3)
Data analysis software	GraphPad Prism	9.0.0	Analysis data and make figures
Data analysis software	Excel		Analysis data
DMSO	Supelco	1.02952.1000	Dilute compounds
DPBS	Gibco	14190-144	Prepare solution
EDTA	Calbiochem	344504	Prevent proteolysis during sonication
Glutathione	Sigma	G-4251	Elute GST-tagged proteins
Glutathione donor beads	Perkin Elmer	6765300	Donor bead
GST-trap column	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	Purify GST-tagged proteins
Isopropyl-β-D-thiogalactoside	Thermo Fisher Scientific	R0392	Induce protein expression
LB Broth (Miller)	Sigma	L3522	Microbial growth medium
PCR instrument	BIO-RAD	S1000 Thermal Cycler	Amplification/PCR
PD-10 column	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	Solution exchange
pGEX-6P-1 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	Plasmid
pGEX-6P-2 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954650	Plasmid
Plate reader	Perkin Elmer	EnSpire 2300 Multilabel Reader	Read alpha plate
Plate reader software	Perkin Elmer	EnSpire Manager	Plate reader software
Plate reader software protocol	Perkin Elmer	Alpha 384-well Low volume	Use this protocol to read plate
PMSF	Sigma	P7626	Prevent proteolysis during sonication
protease inhibitor cocktail	Sigma	S8830	Prevent proteolysis during sonication
Sodium azide	Sigma	S2002	As a preservative
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)	Sigma	156159	Activates matrix for coupling
Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform	Peptide 2.0 inc		Synthesize Hsp90 C-terminal peptide
Test-Tube Rotator	LABINCO		Make end-over-end agitation
Tris-HCl	Sigma	10708976001	Block unreacted sites of acceptor beads
Tween-20	Sigma	P1379	Prevent beads aggregation
Ultra centrifuge Avanti J-20 XP	Beckman Coulter		Centrifuge to get bacteria cell pellets
Ultrasonic cell disruptor	Microson		Sonicate cells to release protein
Unconjugated acceptor beads	Perkin Elmer	6762003	Acceptor beads
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module	Invitrogen	EI0002	SDS-PAGE