Embryologiske manipulationer såsom udryddelse og transplantation af celler er vigtige værktøjer til at studere tidlig udvikling. Denne protokol beskriver en enkel og effektiv transplantation enhed til at udføre disse manipulationer i zebrafisk embryoner.
Klassiske embryologiske manipulationer, såsom fjernelse af celler og transplantation af celler i eller mellem embryoner, er kraftfulde teknikker til at studere komplekse udviklingsprocesser. Zebrafisk embryoner er ideelle til disse manipulationer, da de er let tilgængelige, relativt store i størrelse og gennemsigtige. Men tidligere udviklede enheder til cellefjernelse og transplantation er besværlige at bruge eller dyre at købe. I modsætning hertil er den transplantationsenhed, der præsenteres her, økonomisk, nem at samle og nem at bruge. I denne protokol introducerer vi først håndteringen af transplantationsenheden samt dens samling fra kommercielt og bredt tilgængelige dele. Vi præsenterer derefter tre applikationer til dets anvendelse: generering af ektopiske kloner til at studere signalspredning fra lokaliserede kilder, udryddelse af celler til fremstilling af størrelsesreducerede embryoner og kimlinjetransplantation for at generere moder-zygotiske mutanter. Endelig viser vi, at værktøjet også kan bruges til embryologiske manipulationer hos andre arter som den japanske risfisk medaka.
Fra de klassiske eksperimenter af Mangold og Spemann, der viste eksistensen af en organisator, der instruerer dannelsen af en embryonal akse1, er transplantation af celler mellem embryoner blevet en etableret teknik til undersøgelse af embryonal udvikling2,3,4,5,6,7,8,9,10 . En almindeligt anvendt opsætning til transplantation består af et mikrometerdrevstyret gastæt sprøjte, der er forbundet til en mikropipetteholder gennem fleksibel slange og et reservoir fyldt med mineralsk olie12,13. I denne opsætning flyttes sprøjtens stempel gennem en skrue. Trykket, der genereres på denne måde, overføres til mikropipetten og bruges til at trække celler ud fra et embryo og deponere dem i et andet. Denne hydraulisk drevne enhed består dog af mange dele og er besværlig at samle fra bunden. Lignende enheder kan også købes som et komplet arbejdssæt, der normalt sælges som manuelle mikroinjektorer, og disse kommercielle versioner koster typisk mere end 1500 US $. I både den hjemmelavede og den kommercielle version adskilles mikropipetten til embryomanipulation fra den trykproducerende enhed (den gastætte sprøjte) gennem oliefyldte slanger. Manipulationen af mikropipetten og stemplets bevægelse skal derfor betjenes separat med forskellige hænder, hvilket reducerer gennemløbet og nytten. Desuden er enhederne besværlige at forberede sig på transplantation, da slangen skal omhyggeligt fyldes med olie og samtidig undgå dannelsen af bobler. Her beskriver vi en alternativ pneumatisk betjent enhed til cellefjernelse og transplantation, der er billig, nem at samle og nem at bruge.
Den her præsenterede anordning består af en 25 μL gastæt sprøjte udstyret med en mikropipetteholder og koster mindre end 80 USD i alt. Enheden kan nemt samles ved at indsætte mikropipetteholderen i sprøjten via Luer-låsemontering (figur 1A). Enheden er derefter direkte monteret på en mikromanipulator, så brugeren kan styre både sin position og suge med en enkelt hånd direkte på mikromanipulatoren. Dette efterlader bekvemt den anden hånd fri til at stabilisere og flytte transplantationsskålen, der indeholder donor- og værtsfostre. Enheden fungerer ved direkte sugning med luft og behøver ikke at blive fyldt med mineralsk olie. På grund af de attraktive kræfter mellem vandet og glasnålens vægge oversættes en stor bevægelse i sprøjtens stempel til en mindre bevægelse i vandstanden i nålen, så længe vandstanden er i den tilspidsede ende af glasnålen. Dette giver mulighed for præcis kontrol over antallet af indsugningsceller og placeringen af deres indsættelse.
For at demonstrere nytten af denne enhed præsenterer vi tre applikationer i zebrafisk (Danio rerio) embryoner. For det første viser vi, hvordan man genererer lokaliserede kilder til udskillede signalmolekyler, som kan bruges til at studere gradientdannelse2,4,6. Her injiceres donorembryoner med mRNA, der kodning et fluorescerende mærket signalmolekyle. De fluorescensmærkede donorceller transplanteres derefter til værtsfostre af vildtypen, hvor dannelsen af en signalgradient kan afbildes og analyseres. For det andet beskriver vi, hvordan enheden kan bruges til at fjerne celler ved extirpation for at generere størrelsesreducerede embryoner5,13. Endelig viser vi, hvordan man robust producerer moder-zygotiske mutanter ved at transplantere celler, der bærer en urcellereporter i værtsfostre, hvor kimlinjen var blevet ablated6,10. I fremtiden kan den transplantationsanordning, der er beskrevet her, let tilpasses andre embryologiske manipulationer, der kræver fjernelse eller transplantation af celler.
Succesen med et transplantationseksperiment afhænger i høj grad af eksperimentatorens finmotoriske færdigheder. For at kunne udføre procedurerne er det nødvendigt med praksis. Det instrument, der præsenteres her, er imidlertid relativt let at lære og bruge sammenlignet med andre på markedet, og generelt er der kun brug for nogle få dages praksis.
Succesen af transplantationsproceduren kan forbedres ved at tage flere forholdsregler. Et skridt er at sikre, at mikromanipulatoren er af god kvalitet og i stand til at fungere problemfrit. Tilføjelse af en okulær med højere forstørrelse til stereomikroskopet kan bidrage til præcist at placere nålen i forhold til embryoet. Brug af velavlende zebrafisk eller medaka til at erhverve sunde embryoner og passe på ikke at beskadige embryonerne under håndtering (især under og efter dechorioneringstrinnet) vil også øge succesraten.
Problemer med forsinket toksicitet kan være vanskeligere at foretage fejlfinding. Hvis et foster dør efter et par timer – men ikke umiddelbart efter transplantationen – kan æggeblommen være blevet beskadiget af nålen (f.eks. ved at komme ind i embryoet for dybt), eller måske blev cellerne skubbet for kraftigt ud. Forsinket toksicitet og embryonal død kan også skyldes æggeblomme eller celleaffald injiceret sammen med donorcellerne; en anden årsag kan forringes HEPES buffer i Ringers løsning. Disse problemer kan overvindes ved at vaske cellerne (se trin 1.3.8) eller ved blot at bruge et nyt parti buffer. Desuden kan deforme værtsfostre i kimlinjetransplantationsforsøg skyldes for høje morfolinokoncentrationer. Det er afgørende at bruge nok morpholino til fuldt ud at ablate værtens vilde kønslinje og derved forhindre disse celler i at bidrage til afkommet – men samtidig skal for høje morpholinokoncentrationer undgås. Konsekvente morpholino-mængder på tværs af alle injicerede værtsfostre (et par hundrede i et typisk eksperiment) er derfor nøglen til succes for kimlinjetransplantationer. Dette kan hjælpes ved at supplere morpholino injektion mix med en let synlig sporstofstof14, som kan spores under en fluorescens stereomikroskop for at sikre, at alle embryoner får den samme injektion volumen.
De procedurer, der er beskrevet i denne protokol, involverer udelukkende manipulationer af celler i blastula-stadium zebrafisk eller medaka embryoner, men i fremtiden vil det sandsynligvis være muligt at tilpasse enheden til forskellige stadier og arter ved at ændre diameteren og formen af transplantationsnålen.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt blev støttet af Max Planck Society og modtog støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EU’s Horisont 2020-forsknings- og innovationsprogram (tilskudsaftale nr. 637840 (QUANTPATTERN) og tilskudsaftale nr. 863952 (ACE-OF-SPACE)).
1.0 mm glass capillary, ends cut without filament | To make the transplantation needle | ||
200 mL glass beaker | For embryo dechorionation | ||
24-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
6-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
Agarose | To coat plastic dishes | ||
Dnd1 morpholino | Gene Tools | Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT |
|
Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source | To assess YSL injections and germ-line transplantations | ||
Glass micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | To make the transplantation needle |
Glass pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge |
Incubator at 28 °C | For incubating zebrafish embryos | ||
Luer tip 25 μL Hamilton syringe, 1700 series | Hamilton | Ref: 80201 | Part of the transplantation device |
Manual micromanipulator with 3 axes of movement | Narishige | M-152 | For controlling the transplantation device |
Manual pipetting pump | Bio-Tek | Cat. # 641 | For use with the glass pipettes to transfer embryos |
Metal dissecting probe | For moving and rotating zebrafish embryos | ||
Microforge | Narishige | MF2 | To make the transplantation needle |
Microinjection apparatus | For injection of mRNA and morpholino into embryos | ||
Microinjection molds, triangular grooves | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare microinjection plates with agarose |
Microinjection-molds, single wells | Adaptive Science Tools | PT-1 | To prepare transplantation plates with agarose |
Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary | World Precision Instruments | MPH6S10 | Part of the transplantation device |
mMessage mMachine Sp6 transcription kit |
Life Technologies | AM1340M | To generate capped mRNA for injection into embryos |
Plasmid with GFP-nos1 3'UTR | Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3'UTR of nos1 | ||
Plastic petri dish 100 mm | To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes | ||
Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos |
Ringer’s solution | For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration | ||
Stereomicroscope | For injection and transplantation |