Embryologiske manipulasjoner som utryddelse og transplantasjon av celler er viktige verktøy for å studere tidlig utvikling. Denne protokollen beskriver en enkel og effektiv transplantasjonsenhet for å utføre disse manipulasjonene i sebrafiskembryoer.
Klassiske embryologiske manipulasjoner, som å fjerne celler og transplantere celler i eller mellom embryoer, er kraftige teknikker for å studere komplekse utviklingsprosesser. Sebrafisk embryoer er ideelle for disse manipulasjonene siden de er lett tilgjengelige, relativt store i størrelse og gjennomsiktige. Tidligere utviklede enheter for cellefjerning og transplantasjon er imidlertid tungvint å bruke eller dyrt å kjøpe. Derimot er transplantasjonsenheten som presenteres her økonomisk, enkel å montere og enkel å bruke. I denne protokollen introduserer vi først håndteringen av transplantasjonsenheten samt monteringen fra kommersielt og allment tilgjengelige deler. Vi presenterer deretter tre applikasjoner for bruk: generering av ektopiske kloner for å studere signaldispergering fra lokaliserte kilder, utryddelse av celler for å produsere størrelsesreduserende embryoer og bakterietransplantasjon for å generere maternal-zygotiske mutanter. Til slutt viser vi at verktøyet også kan brukes til embryologiske manipulasjoner i andre arter som den japanske risfiskmedakaen.
Fra de klassiske eksperimentene til Mangold og Spemann som demonstrerte eksistensen av en arrangør som instruerer dannelsen av en embryonal akse1, har transplantasjon av celler mellom embryoer blitt en etablert teknikk for å studere embryonal utvikling2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Et vanlig brukt oppsett for transplantasjon består av en mikrometerdrivkontrollert gasstett sprøyte koblet til en mikropipetteholder gjennom fleksibel rør og et reservoar fylt med mineralolje12,13. I dette oppsettet flyttes sprøytens stempel gjennom en skrue. Trykket som genereres på denne måten overføres til mikropipetten og brukes til å trekke celler ut fra ett embryo og deponere dem i et annet. Denne hydraulisk opererte enheten består imidlertid av mange deler og er arbeidskrevende å montere fra bunnen av. Lignende enheter kan også kjøpes som et komplett arbeidssett, vanligvis solgt som manuelle mikroinjektorer, og disse kommersielle versjonene koster vanligvis mer enn 1500 US $. I både hjemmelaget og kommersiell versjon skilles mikropipetten for embryomanipulering fra den trykkgenererende enheten (den gasstette sprøyten) gjennom oljefylte rør. Manipuleringen av mikropipetten og bevegelsen av stempelet må derfor betjenes separat med forskjellige hender, noe som reduserer gjennomstrømningen og verktøyet. Videre er enhetene tungvint for å forberede seg på transplantasjon siden slangen må fylles forsiktig med olje samtidig som man unngår dannelsen av bobler. Her beskriver vi en alternativ pneumatisk operert enhet for cellefjerning og transplantasjon som er billig, enkel å montere og enkel å bruke.
Enheten som presenteres her består av en 25 μL gasstett sprøyte utstyrt med en mikropipetteholder og koster mindre enn 80 US $ helt. Enheten monteres enkelt ved å sette mikropipetteholderen inn i sprøyten via Luer-låsebeslag (figur 1A). Enheten monteres deretter direkte på en mikromanipulator, slik at brukeren kan kontrollere både posisjonen og suget med en enkelt hånd direkte på mikromanipulatoren. Dette etterlater den andre hånden fri til å stabilisere og flytte transplantasjonsfatet som inneholder donor og vert embryoer. Enheten fungerer ved direkte sug med luft og trenger ikke å fylles med mineralolje. På grunn av de attraktive kreftene mellom vannet og glassnålens vegger, oversettes en stor bevegelse i sprøytens stempel til en mindre bevegelse i vannstanden i nålen, så lenge vannstanden er i den koniske enden av glassnålen. Dette gir nøyaktig kontroll over antall aspirerte celler og plasseringen av innsettingen.
For å demonstrere nytten av denne enheten, presenterer vi tre applikasjoner i sebrafisk (Danio rerio) embryoer. Først viser vi hvordan man genererer lokaliserte kilder til utskilte signalmolekyler, som kan brukes til å studere gradientdannelse2,4,6. Her injiseres donorembryoer med mRNA-koding av et fluorescerende merket signalmolekyl. De fluorescensmerkede donorcellene blir deretter transplantert til villtype vertsembryoer der dannelsen av en signalgradient kan avbildes og analyseres. For det andre beskriver vi hvordan enheten kan brukes til å fjerne celler ved utryddelse for å generere størrelsesreduserende embryoer5,13. Til slutt viser vi hvordan vi robust kan produsere maternal-zygotiske mutanter ved å transplantere celler som bærer en primordial bakteriecellereporter inn i vertsembryoer der bakterielinjen hadde blitt ablated6,10. I fremtiden kan transplantasjonsenheten beskrevet her lett tilpasses andre embryologiske manipulasjoner som krever fjerning eller transplantasjon av celler.
Suksessen til et transplantasjonseksperiment er sterkt avhengig av eksperimentets fine motoriske ferdigheter. For å kunne utføre prosedyrene, er det nødvendig med praksis. Instrumentet som presenteres her er imidlertid relativt enkelt å lære og bruke sammenlignet med andre på markedet, og generelt er det bare noen få dagers praksis som trengs.
Suksessen til transplantasjonsprosedyren kan forbedres ved å ta flere forholdsregler. Et trinn er å sikre at mikromanipulatoren er av god kvalitet og i stand til jevn drift. Å legge til en okulær med høyere forstørrelse til stereomikroskopet kan bidra til å nøyaktig plassere nålen i forhold til embryoet. Bruk av godt avl av sebrafisk eller medaka for å skaffe sunne embryoer og passe på å ikke skade embryoene under håndtering (spesielt under og etter dechorionation trinnet) vil også forbedre suksessraten.
Problemer med forsinket toksisitet kan være vanskeligere å feilsøke. Hvis et embryo dør etter noen timer – men ikke umiddelbart etter transplantasjon – kan eggeplommen ha blitt skadet av nålen (f.eks. ved å komme inn i embryoet for dypt), eller kanskje cellene ble kastet ut for kraftig. Forsinket toksisitet og embryonal død kan også skyldes eggeplomme eller cellerester injisert sammen med donorcellene; en annen årsak kan forverre HEPES-bufferen i Ringers løsning. Disse problemene kan løses ved å vaske cellene (se trinn 1.3.8) eller ved å bare bruke en ny bunke buffer, henholdsvis. Videre kan deformerte vertsembryoer i bakterietransplantasjonsforsøk skyldes for høye morpholinokonsentrasjoner. Det er viktig å bruke nok morpholino til å fyre opp vertens villtype bakterie, og dermed forhindre at disse cellene bidrar til avkom – men samtidig må for høye morpholinokonsentrasjoner unngås. Konsistente morpholinomengder på tvers av alle injiserte vertsembryoer (noen få hundre i et typisk eksperiment) er derfor nøkkelen til suksessen med bakterietransplantasjoner. Dette kan hjelpes ved å supplere morpholino injeksjon blandingen med en lett synlig tracer dye14, som kan spores under en fluorescens stereomikroskop for å sikre at alle embryoer får samme injeksjonsvolum.
Prosedyrene beskrevet i denne protokollen innebærer utelukkende manipulasjoner av celler i blastula-stadium sebrafisk eller medaka embryoer, men i fremtiden vil det sannsynligvis være mulig å tilpasse enheten til forskjellige stadier og arter ved å endre diameteren og formen på transplantasjonsnålen.
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet ble støttet av Max Planck Society og fikk støtte fra Det europeiske forskningsrådet (ERC) under EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 (tilskuddsavtale nr. 637840 (QUANTPATTERN) og tilskuddsavtale nr 863952.
1.0 mm glass capillary, ends cut without filament | To make the transplantation needle | ||
200 mL glass beaker | For embryo dechorionation | ||
24-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
6-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
Agarose | To coat plastic dishes | ||
Dnd1 morpholino | Gene Tools | Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT |
|
Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source | To assess YSL injections and germ-line transplantations | ||
Glass micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | To make the transplantation needle |
Glass pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge |
Incubator at 28 °C | For incubating zebrafish embryos | ||
Luer tip 25 μL Hamilton syringe, 1700 series | Hamilton | Ref: 80201 | Part of the transplantation device |
Manual micromanipulator with 3 axes of movement | Narishige | M-152 | For controlling the transplantation device |
Manual pipetting pump | Bio-Tek | Cat. # 641 | For use with the glass pipettes to transfer embryos |
Metal dissecting probe | For moving and rotating zebrafish embryos | ||
Microforge | Narishige | MF2 | To make the transplantation needle |
Microinjection apparatus | For injection of mRNA and morpholino into embryos | ||
Microinjection molds, triangular grooves | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare microinjection plates with agarose |
Microinjection-molds, single wells | Adaptive Science Tools | PT-1 | To prepare transplantation plates with agarose |
Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary | World Precision Instruments | MPH6S10 | Part of the transplantation device |
mMessage mMachine Sp6 transcription kit |
Life Technologies | AM1340M | To generate capped mRNA for injection into embryos |
Plasmid with GFP-nos1 3'UTR | Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3'UTR of nos1 | ||
Plastic petri dish 100 mm | To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes | ||
Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos |
Ringer’s solution | For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration | ||
Stereomicroscope | For injection and transplantation |