Embryological manipulationer såsom extirpation och transplantation av celler är viktiga verktyg för att studera tidig utveckling. Detta protokoll beskriver en enkel och effektiv transplantation enhet för att utföra dessa manipuleringar i zebrafisk embryon.
Klassiska embryologiska manipuleringar, som att ta bort celler och transplantera celler inom eller mellan embryon, är kraftfulla tekniker för att studera komplexa utvecklingsprocesser. Zebrafiskembryon är idealiska för dessa manipuleringar eftersom de är lättillgängliga, relativt stora i storlek och transparenta. Tidigare utvecklade enheter för cellborttagning och transplantation är dock besvärliga att använda eller dyra att köpa. Däremot är transplantationsanordningen som presenteras här ekonomisk, lätt att montera och enkel att använda. I detta protokoll introducerar vi först hanteringen av transplantationsanordningen samt dess montering från kommersiellt och allmänt tillgängliga delar. Vi presenterar sedan tre tillämpningar för dess användning: generering av utomkvedshavande kloner för att studera signalspridning från lokaliserade källor, extirpation av celler för att producera storleksreducerade embryon och könscellstransplantation för att generera moderns zygotiska mutanter. Slutligen visar vi att verktyget också kan användas för embryologiska manipuleringar hos andra arter som den japanska risfiskmedaka.
Från de klassiska experimenten av Mangold och Spemann som visade existensen av en organisatör som instruerar bildandet av en embryonal axel1, har transplantation av celler mellan embryon blivit en etablerad teknik för att studera embryonal utveckling2,3,4,5,6,7,8,9,10 . En vanlig installation för transplantation består av en mikrometerstyrd gastät spruta ansluten till en mikropipettehållare genom flexibla slangar och en reservoar fylld med mineralolja12,13. I denna inställning flyttas sprutans kolv genom en skruv. Trycket som genereras på detta sätt överförs till mikropipetten och används för att dra celler ut från ett embryo och deponera dem i ett annat. Denna hydrauliskt drivna enhet består dock av många delar och är mödosam att montera från början. Liknande enheter kan också köpas som en komplett arbetsuppsättning, vanligtvis säljs som manuella mikroinjektorer, och dessa kommersiella versioner kostar vanligtvis mer än 1500 US $. I både den hemgjorda och den kommersiella versionen separeras mikropipetten för embryomanipulation från den tryckgenererande enheten (den gastäta sprutan) genom oljefyllda slangar. Manipulering av mikropipetten och kolvens rörelse måste därför drivas separat med olika händer, vilket minskar genomströmningen och nyttan. Dessutom är enheterna besvärliga att förbereda för transplantation eftersom slangen måste fyllas noggrant med olja samtidigt som man undviker bildandet av bubblor. Här beskriver vi en alternativ pneumatiskt styrd enhet för cellborttagning och transplantation som är billig, lätt att montera och enkel att använda.
Enheten som presenteras här består av en 25 μL gastät spruta utrustad med en mikropipettehållare och kostar mindre än 80 US $ totalt. Enheten monteras enkelt genom att mikropipettens hållare förs in i sprutan via Luer-låskoppling (bild 1A). Enheten monteras sedan direkt på en mikromanipulator, så att användaren kan styra både sin position och suget med en enda hand direkt vid mikromanipulatorn. Detta lämnar bekvämt den andra handen fri att stabilisera och flytta transplantationsfatet som innehåller donator- och värdembryon. Enheten fungerar genom direkt sug med luft och behöver inte fyllas med mineralolja. På grund av de attraktiva krafterna mellan vattnet och glasnålens väggar översätts en stor rörelse i sprutans kolv till en mindre rörelse i vattennivån i nålen, så länge vattennivån är i glasnålens avsmalnande ände. Detta ger exakt kontroll över antalet aspirerade celler och platsen för deras insättning.
För att demonstrera nyttan av denna enhet presenterar vi tre applikationer i zebrafisk (Danio rerio) embryon. Först visar vi hur man genererar lokaliserade källor till utsöndrade signalmolekyler, som kan användas för att studera gradientbildning2,4,6. Här injiceras donatorembryon med mRNA som kodar en fluorescerande märkt signalmolekyl. De fluorescensmärkta donatorcellerna transplanteras sedan till värdembryon av vild typ där bildandet av en signalgradient kan avbildas och analyseras. För det andra beskriver vi hur enheten kan användas för att avlägsna celler genom extirpation för att generera storleksreducerade embryon5,13. Slutligen visar vi hur man robust producerar moderns zygotiska mutanter genom att transplantera celler som bär en ursprunglig bakteriecellsreporter till värdembryon där bakterielinjen hade ablated6,10. I framtiden kan transplantationsanordningen som beskrivs här enkelt anpassas till andra embryologiska manipuleringar som kräver avlägsnande eller transplantation av celler.
Framgången för ett transplantationsexperiment beror starkt på experimenterarens finmotoriska färdigheter. För att framgångsrikt utföra förfarandena krävs övning. Det instrument som presenteras här är dock relativt lätt att lära sig och använda jämfört med andra på marknaden, och i allmänhet behövs bara några dagars övning.
Framgången med transplantationsförfarandet kan förbättras genom att vidta flera försiktighetsåtgärder. Ett steg är att se till att mikromanipulatorn är av god kvalitet och kan fungera smidigt. Att tillsätta en okulär med högre förstoring till stereomikroskopet kan hjälpa till att exakt placera nålen i förhållande till embryot. Att använda väl avel zebrafisk eller medaka för att förvärva friska embryon och se till att inte skada embryona under hanteringen (särskilt under och efter dechorionationssteget) kommer också att öka framgångsgraden.
Problem med fördröjd toxicitet kan vara svårare att felsöka. Om ett embryo dör efter några timmar – men inte omedelbart efter transplantation – kan äggulan ha skadats av nålen (t.ex. genom att komma in i embryot för djupt), eller kanske cellerna kastades ut för kraftfullt. Fördröjd toxicitet och embryonal död kan också bero på äggula eller cellrester injicerade tillsammans med donatorcellerna; en annan orsak kan försämra HEPES-bufferten i Ringers lösning. Dessa problem kan övervinnas genom att tvätta cellerna (se steg 1.3.8) eller genom att helt enkelt använda en ny sats buffert. Dessutom kan deformerade värdembryon i könsceller transplantation experiment vara resultatet av alltför höga morpholino koncentrationer. Det är viktigt att använda tillräckligt med morpholino för att helt ablatera värdens vilda könsceller, vilket förhindrar att dessa celler bidrar till avkomman – men samtidigt måste alltför höga morfolinokoncentrationer undvikas. Konsekventa morfinolino mängder över alla injicerade värdembryon (några hundra i ett typiskt experiment) är därför nyckeln till framgång av bakteriella transplantationer. Detta kan hjälpas genom att komplettera morpholino injektionsblandningen med ett väl synligt spårämne14, som kan spåras under ett fluorescensstereomikroscope för att säkerställa att alla embryon får samma injektionsvolym.
De förfaranden som beskrivs i detta protokoll omfattar uteslutande manipuleringar av celler i blastula-stadium zebrafisk eller medaka embryon, men i framtiden kommer det sannolikt att vara möjligt att anpassa enheten till olika stadier och arter genom att ändra diametern och formen på transplantationsnålen.
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt stöddes av Max Planck Society och fick finansiering från Europeiska forskningsrådet (ERC) inom ramen för Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 (bidragsavtal nr 637840 (QUANTPATTERN) och bidragsavtal nr 863952 (ACE-OF-SPACE)).
1.0 mm glass capillary, ends cut without filament | To make the transplantation needle | ||
200 mL glass beaker | For embryo dechorionation | ||
24-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
6-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
Agarose | To coat plastic dishes | ||
Dnd1 morpholino | Gene Tools | Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT |
|
Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source | To assess YSL injections and germ-line transplantations | ||
Glass micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | To make the transplantation needle |
Glass pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge |
Incubator at 28 °C | For incubating zebrafish embryos | ||
Luer tip 25 μL Hamilton syringe, 1700 series | Hamilton | Ref: 80201 | Part of the transplantation device |
Manual micromanipulator with 3 axes of movement | Narishige | M-152 | For controlling the transplantation device |
Manual pipetting pump | Bio-Tek | Cat. # 641 | For use with the glass pipettes to transfer embryos |
Metal dissecting probe | For moving and rotating zebrafish embryos | ||
Microforge | Narishige | MF2 | To make the transplantation needle |
Microinjection apparatus | For injection of mRNA and morpholino into embryos | ||
Microinjection molds, triangular grooves | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare microinjection plates with agarose |
Microinjection-molds, single wells | Adaptive Science Tools | PT-1 | To prepare transplantation plates with agarose |
Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary | World Precision Instruments | MPH6S10 | Part of the transplantation device |
mMessage mMachine Sp6 transcription kit |
Life Technologies | AM1340M | To generate capped mRNA for injection into embryos |
Plasmid with GFP-nos1 3'UTR | Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3'UTR of nos1 | ||
Plastic petri dish 100 mm | To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes | ||
Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos |
Ringer’s solution | For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration | ||
Stereomicroscope | For injection and transplantation |