冷冻电镜高温样品网格的制备
Summary
本文提供了在冷冻电镜实验进行冷冻之前在高达 70 °C 的温度下制备样品网格的详细方案。
Abstract
用于冷冻电子显微镜（cryo-EM）实验的样品网格通常在最适合生物样品储存的温度下制备，主要是在4°C下，偶尔在室温下制备。最近，我们发现在低温下解决的蛋白质结构可能与功能无关，特别是对于嗜热古细菌的蛋白质。开发了一种在较高温度（高达70°C）下制备蛋白质样品以进行冷冻电镜分析的程序。我们发现，在较高温度下制备的样品的结构具有功能相关性且与温度相关。在这里，我们以55°C为例描述了在高温下制备样品网格的详细方案。该实验使用使用额外的离心管修饰的玻璃化装置，并将样品在55°C下孵育。 对详细程序进行了微调，以最大程度地减少蒸汽冷凝并在网格上获得一层薄薄的冰。提供了成功和不成功的实验示例。
Introduction
用于求解蛋白质复合物结构的冷冻电镜技术不断改进，特别是在获得高分辨率结构的方向上1，2.同时，在玻璃化过程3之前，通过改变样品条件（例如pH或配体）也扩大了其应用范围，该过程涉及制备样品网格，然后进行冷冻4，5。另一个重要条件是温度。尽管冷冻电镜实验（如X射线晶体学）是在低温下进行的，但冷冻电镜求解的结构反映了玻璃化前溶液状态下的结构。直到最近，大多数单颗粒分析 （SPA） 冷冻电镜研究使用在玻璃化之前保存在冰上的样品6，尽管许多研究使用室温约为 7，8，9，10 或高达 42 °C的样品 11。在最近的一份报告中，我们对嗜热古菌Sulfolobus solfataricus（Sso）的酮酸还原异构酶（KARI）在4°C至70°C的六种不同温度下进行了温度依赖性研究12。我们的研究表明，在功能相关的温度下制备样品网格非常重要，冷冻电镜是唯一在多个温度下求解相同蛋白质复合物结构的实际可行的结构方法。
高温玻璃化的主要难点是尽量减少蒸汽冷凝并实现薄冰。在这里，我们报告了我们之前对 Sso-KARI 12的研究中用于在高温下制备样品网格的详细方案。我们假设读者或观众已经对冷冻电镜实验的整体样品制备和数据处理程序有经验，并强调与高温相关的方面。
Protocol
Representative Results
Discussion
在协议的步骤1中，确保离心管安装良好，并且在实验进行时不会掉落。由于腔室内积聚了大量的水滴，会改变滤纸的吸附能力，建议玻璃化装置腔达到平衡温度后，实验的总时间不应超过30分钟。如果操作时间超过30分钟，操作人员需要更换滤纸，等待机舱再次平衡温度和湿度。在协议的第8步，建议的7-9μL样品体积比平时大，因为否则，样品在高温下会迅速蒸发，导致网格上出现空方块。另一方?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢赛默飞世尔科技的Hervé Remigy博士提供的有用建议。冷冻电镜实验在中央研究院冷冻电镜设施（ASCEM）进行。ASCEM由中央研究院支持（批准号）。AS-CFII-108-110）和台湾蛋白质计划（批准号。AS-KPQ-109-TPP2）。作者还感谢黄慧菊女士在样品制备方面的帮助。
Materials
| Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
| Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | water bath | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
References
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
- Cabra, V., Samsó, M. Do’s and don’ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -. F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
- Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
- Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).
