Préparation de grilles d’échantillons à haute température pour Cryo-EM

Summary

Cet article fournit un protocole détaillé pour la préparation de grilles d’échantillons à des températures aussi élevées que 70 °C, avant la congélation pour les expériences cryo-EM.

Abstract

Les grilles d’échantillons pour les expériences de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) sont généralement préparées à une température optimale pour le stockage d’échantillons biologiques, principalement à 4 °C et parfois à température ambiante. Récemment, nous avons découvert que la structure protéique résolue à basse température peut ne pas être fonctionnellement pertinente, en particulier pour les protéines d’archées thermophiles. Une procédure a été développée pour préparer des échantillons de protéines à des températures plus élevées (jusqu’à 70 ° C) pour l’analyse cryo-EM. Nous avons montré que les structures provenant d’échantillons préparés à des températures plus élevées sont fonctionnellement pertinentes et dépendent de la température. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la préparation de grilles d’échantillons à haute température, en utilisant 55 °C comme exemple. L’expérience a utilisé un appareil de vitrification modifié à l’aide d’un tube de centrifugation supplémentaire, et les échantillons ont été incubés à 55 ° C. Les procédures détaillées ont été affinées pour minimiser la condensation de vapeur et obtenir une fine couche de glace sur la grille. Des exemples d’expériences réussies et infructueuses sont fournis.

Introduction

La technologie cryo-EM pour résoudre les structures des complexes protéiques a continué à s’améliorer, en particulier dans le sens de l’obtention de structures à haute résolution ^1,2. Entre-temps, le paysage de son application a également été élargi en variant les conditions d’échantillon telles que le pH ou les ligands avant le processus de vitrification³, qui implique la préparation de grilles d’échantillons suivie de la congélation^{plongeante 4,5}. Une autre condition importante est la température. Bien que les expériences cryo-EM, comme la cristallographie aux rayons X, soient effectuées à basse température, la structure résolue par cryo-EM reflète la structure à l’état de solution avant la vitrification. Jusqu’à récemment, la majorité des études cryo-EM d’analyse par particules uniques (SPA) utilisent des échantillons conservés sur de la glace (c.-à-d. à 4 °C) avant la vitrification⁶, bien qu’un certain nombre d’études utilisent des échantillons à une température ambiante d’environ 7,8,9,10 ou aussi élevée que 42 °C ¹¹. Dans un rapport récent, nous avons effectué des études dépendantes de la température de l’enzyme cétol-acide réductatosomerase (KARI) de l’archéon thermophile Sulfolobus solfataricus (Sso) à six températures différentes de 4 ° C à 70 ° C¹². Nos études suggèrent qu’il est important de préparer des grilles d’échantillons à des températures fonctionnellement pertinentes et que la cryo-EM est la seule méthode structurelle pratiquement réalisable pour résoudre la structure du même complexe protéique à plusieurs températures.

La principale difficulté pour la vitrification à haute température est de minimiser la condensation de vapeur et d’obtenir de la glace mince. Nous rapportons ici le protocole détaillé utilisé pour préparer des grilles d’échantillons à haute température dans notre étude précédente du Sso-KARI ¹². Nous supposons que les lecteurs ou les téléspectateurs ont déjà de l’expérience dans les procédures globales de préparation des échantillons et de traitement des données pour les expériences cryo-EM et mettons l’accent sur les aspects pertinents pour les températures élevées.

Protocol

NOTE: Ce protocole vise à utiliser un appareil de vitrification commerciale modifié pour préparer les échantillons de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) à des températures spécifiques, en particulier supérieures à 37 ° C. La configuration expérimentale globale est illustrée à la figure 1. Le protocole utilise 55 °C comme exemple. Pour les conditions spécifiques à d’autres températures, veuillez vous référer au tableau supplémentaire 2 de la référence<sup class=…

Representative Results

La vue d’ensemble du faible grossissement est illustrée à la figure 5A,B. Le panneau A est un exemple de grille réussie. Il y a un gradient de glace du haut à gauche (plus épais) au bas à droite (plus mince ou vide). Une telle grille facilite la recherche d’une épaisseur appropriée de la couche de glace dans la zone médiane adaptée à la collecte de données, comme les cases bleue et verte. La grille B est trop sèche. Les carrés de la grille ont un contraste …

Discussion

À l’étape 1 du protocole, assurez-vous que le tube de centrifugation a été bien installé et ne tombe pas lorsque l’expérience est en cours. En raison de l’accumulation d’un grand nombre de gouttelettes d’eau dans la chambre, ce qui pourrait modifier la capacité d’adsorption du papier filtre, il est recommandé de ne pas dépasser 30 minutes après que la chambre de l’appareil de vitrification ait atteint la température d’équilibre. Si le temps de fonctionnement dépasse 30 min, l’opérateur doi…

Materials

Falcon tube	Falcon	352070	size: 50 mL
Filter paper	Ted Pella	47000-100	Ø55/20mm, Grade 595
HI1210	Leica		water bath
K100X	Electron Microscopy Sciences		glow discharge
Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid	Ted Pella	658-200-CU-100
Titan Krios G3	Thermo Fisher Scientific	1063996	low dose imaging
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	1086439
Vitrobot Tweezer	Ted Pella	47000-500