Análise quantitativa da taxa de crescimento de nidulans aspergillus usando microscopia ao vivo e software de código aberto
Summary
Apresentamos um protocolo de imagem ao vivo sem rótulos usando técnicas de microscopia de luz transmitida para capturar imagens, analisar e quantificar a cinética de crescimento do fungo filamentoso A. nidulans em culturas submersas e mídia sólida. Este protocolo pode ser usado em conjunto com microscopia de fluorescência.
Abstract
Está bem estabelecido que o crescimento de fungos filamentosos, principalmente dependentes de mudanças na taxa de crescimento hifa/micáceico, é macroscopicamente estimado em mídia solidificada comparando o tamanho da colônia. No entanto, medir quantitativamente a taxa de crescimento de cepas ou cepas fúngicas geneticamente diferentes sob diferentes condições ambientais/de crescimento (pH, temperatura, fontes de carbono e nitrogênio, antibióticos, etc.) é um desafio. Assim, a busca de abordagens complementares para quantificar a cinética do crescimento torna-se obrigatória para entender melhor o crescimento das células fúngicas. Além disso, é sabido que fungos filamentosos, incluindo aspergillus spp., possuem modos distintos de crescimento e diferenciação sob condições sub-aéreas em mídia sólida ou culturas submersas. Aqui, detalhamos um método microscópico quantitativo para analisar a cinética de crescimento do fungo modelo Aspergillus nidulans, utilizando imagens vivas em culturas submersas e mídia sólida. Capturamos imagens, analisamos e quantificamos as taxas de crescimento de diferentes cepas fúngicas de forma reprodutível e confiável usando um software livre de código aberto para bioimagens (por exemplo, Fiji), de uma forma que não exija qualquer experiência prévia de análise de imagem do usuário.
Introduction
Os fungos filamentosos são de grande importância socioeconômica e ecológica, sendo tanto cruciais quanto ferramentas industriais/agrícolas para a produção de enzimas e antibióticos1,2 e como patógenos de plantas agrícolas3, insetos depragas 4 e humanos3. Além disso, fungos filamentosos como os nidulans Aspergillus são amplamente utilizados como organismos-modelo para pesquisas fundamentais, como estudos em genética, biologia celular e evolutiva, bem como para o estudo da extensão hifal5. Fungos filamentosos são organismos altamente polarizados que alongam o fornecimento contínuo de lipídios/proteínas de membrana e a nova síntese da parede celular na ponta de extensão6. Um papel central no crescimento da ponta hífa e na manutenção da polaridade é uma estrutura especializada chamada ‘Spitzenkorper’ (SPK), uma estrutura altamente ordenada composta principalmente por componentes citoesqueléticos e distribuição polarizada do Golgi6,7,8.
Estímulos/sinais ambientais, tais interface água-ar, luz, concentração de CO2 e o estado nutricional são responsáveis pelas decisões de desenvolvimento tomadas por esses moldes9. Nas culturas submersas (líquidas) a diferenciação de A. nidulans é reprimida e o crescimento ocorre por alongamento da ponta hiphal6. Durante o crescimento vegetativo, esporos assexuados (conidia) germinam por extensão apical, formando uma rede indiferenciada de células hifamais interconectadas, o micélio, que pode continuar a crescer indefinidamente enquanto nutrientes e espaço estiverem disponíveis. Por outro lado, em pontas higiféricas de mídia sólida alongam e após um período definido de crescimento vegetativo (competência do desenvolvimento), inicia-se a reprodução assexual e os talos de conidiophore aéreo se estendem das células especializadas do pé domicélio 6. Estes dão origem a estruturas multicelulares especializadas de desenvolvimento chamadas conidioforos, que produzem longas cadeias de conidia10 haploide que podem reiniciar o crescimento em condições ambientais favoráveis.
Um método amplamente utilizado para medir o crescimento fúngico filamentoso é inocular esporos em ágar nutrientes contidos em uma placa de Petri e medir macroscopicamente o diâmetro da colônia alguns diasdepois 11. O diâmetro/área da colônia, mais dependente de mudanças na taxa de crescimento micelial e menos na densidade conidiophore12,é então usado como um valor de crescimento. Embora, medir o tamanho da população fúngica (colônia) crescendo em superfícies sólidas seja bastante adequado, não é de forma alguma a medida mais precisa de crescimento. Em comparação com as médias populacionais (médias do tamanho da colônia fúngica), as medições de células únicas podem capturar a heterogeneidade de uma população celular e permitir a identificação de novas subsédias de células, afirma13, dinâmicas, caminhos, bem como os mecanismos biológicos pelos quais as células respondem a mudanças endógenas e ambientais14,15. Monitorar o crescimento e o fenótipo das células fúngicas por microscopia de lapso de tempo é, sem dúvida, a abordagem de observação de células únicas quantitativas mais amplamente empregadas.
Aqui, detalhamos um protocolo de imagem ao vivo sem rótulos usando técnicas de microscopia de luz transmitida (como contraste de fase, contraste de interferência diferencial (DIC) e microscopia polarizada) para capturar imagens, que independentemente do uso combinado de microscopia de fluorescência podem ser empregadas para analisar e quantificar o crescimento polar de cepas de A. nidulans em culturas submersas e mídia sólida.
Protocol
Representative Results
Discussion
Monitorar o crescimento e o fenótipo das células fúngicas por microscopia de lapso de tempo é uma abordagem poderosa para avaliar o comportamento celular em tempo real e quantitativamente e com precisão e determinar com precisão se um tratamento medicamentoso específico e/ou intervenção genética resulta em crescimento celular detectável ou diferenças fenotípicas ao longo do tempo.
Neste estudo, foi descrita uma metodologia confiável de imagem de células vivas para medir e analis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo projeto “Uma Infraestrutura de Pesquisa Grega para Visualização e Monitoramento de Processos Biológicos Fundamentais (BioImaging-GR)” (MIS 5002755) que é implementado sob a Ação “Reforço da Infraestrutura de Pesquisa e Inovação”, financiado pelo Programa Operacional “Competitividade, Empreendedorismo e Inovação” (NSRF 2014-2020) e co-financiado pela Grécia e pela E. U.
Materials
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
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