Kvantitativ analys av Aspergillus nidulans tillväxttakt med hjälp av livemikroskopi och programvara med öppen källkod
Summary
Vi presenterar ett etikettfritt live imaging protokoll med hjälp av överförda lätta mikroskopi tekniker för att fånga bilder, analysera och kvantifiera tillväxt kinetik av filamentous svamp A. nidulaner i både nedsänkta kulturer och fasta medier. Detta protokoll kan användas tillsammans med fluorescensmikroskopi.
Abstract
Det är väl fastställt att kolonitillväxt av filamentösa svampar, främst beroende av förändringar i hyphae/ mycelia apical tillväxttakt, makroskopiskt uppskattas på stelnade medier genom att jämföra kolonistorlek. Att kvantitativt mäta tillväxttakten för genetiskt olika svampstammar eller stammar under olika miljö-/tillväxtförhållanden (pH, temperatur, kol- och kvävekällor, antibiotika osv.) är dock utmanande. Således blir strävan efter kompletterande metoder för att kvantifiera tillväxtkinetik obligatorisk för att bättre förstå svampcellstillväxt. Dessutom är det välkänt att filamentösa svampar, inklusive Aspergillus spp., har distinkta tillväxt- och differentieringssätt under undervattensförhållanden på fasta medier eller nedsänkta kulturer. Här beskriver vi en kvantitativ mikroskopisk metod för att analysera tillväxtkinetik av modellsvampen Aspergillus nidulans, med hjälp av levande avbildning i både nedsänkta kulturer och fasta medier. Vi tar bilder, analyserar och kvantifierar tillväxthastigheter för olika svampstammar på ett reproducerbart och tillförlitligt sätt med hjälp av en öppen källkod, fri programvara för biobilder (t.ex. Fiji), på ett sätt som inte kräver någon tidigare bildanalysexpertis från användaren.
Introduction
Filamentösa svampar är av stor socioekonomisk och ekologisk betydelse, vilket är både avgörande som industriella / jordbruksverktyg för enzym- ochantibiotikaproduktion 1,2 och som patogener hos växtväxter3, skadedjur4 och människor3. Dessutom används filamentösa svampar som Aspergillus nidulaner ofta som modellorganismer för grundforskning, såsom studier i genetik, cell- och evolutionsbiologi samt för studier av hyphalförlängning5. Filamentösa svampar är starkt polariserade organismer som förlänger genom kontinuerlig tillförsel av membranfetter/proteiner och de novo-syntesen av cellväggen vid förlängningsspetsen6. En central roll i hyphalspetstillväxt och polaritetsunderhåll är en specialiserad struktur som heter “Spitzenkorper” (SPK), en högt beställd struktur som mestadels består av cytoskeletala komponenter och den polariserade fördelningen av Golgi6,7,8.
Miljöstimulanser/signaler, sådant vatten-luftgränssnitt, ljus, CO2-koncentration och näringsstatus är ansvariga för de utvecklingsbeslut som fattas av dessa formar9. I nedsänkta (flytande) kulturer undertrycks differentiering av A. nidulaner och tillväxten sker genom hyphalspetsförlängning6. Under vegetativ tillväxt gror asexuella sporer (conidia) i apical förlängning, bildar ett odifferentierat nätverk av sammankopplade hyphalceller, mycelium, som kan fortsätta att växa på obestämd tid så länge näringsämnen och utrymme finns tillgängliga. Å andra sidan, på fasta medier hyphal tips förlänga och efter en definierad period av vegetativ tillväxt (utvecklingskompetens), asexuell reproduktion initieras och antenn conidiophore stjälkar sträcker sig från specialiserade fotceller i mycelium6. Dessa ger upphov till specialiserade utvecklingsmässiga multicellulära strukturer som kallas conidiophores, som producerar långa kedjor av haploid conidia10 som kan starta om tillväxten under gynnsamma miljöförhållanden.
En allmänt använd metod för att mäta filamentös svamptillväxt är att inokulera sporer på näringsagar som finns i en petriskål och makroskopiskt mäta kolonins diameter några dagar senare11. Kolonins diameter/område, mest beroende av förändringar i mycelial tillväxthastighet och mindre på conidiophore densitet12, används sedan som ett tillväxtvärde. Även om mätning av svamppopulationens (koloni) storlek som växer på fasta ytor är ganska tillräcklig, är det inte på något sätt det mest exakta måttet på tillväxt. Jämfört med medelvärden på befolkningsnivå (medelvärden av svampkolonistorlek) kan encelliga mätningar fånga heterogeniteten hos en cellpopulation och tillåta identifiering av nya subpopulationer av celler,stater 13, dynamik, vägar samt de biologiska mekanismer genom vilka celler svarar på endogena och miljömässigaförändringar 14,15. Övervakning av svamp cell tillväxt och fenotyp av time-lapse mikroskopi är utan tvekan den mest använda kvantitativa encelliga observation strategi.
Häri beskriver vi ett etikettfritt live imaging-protokoll med hjälp av överförda ljusmikroskopitekniker (såsom faskontrast, differentialinterferenskontrast (DIC) och polariserad mikroskopi) för att fånga bilder, som oberoende av den kombinerade användningen av fluorescensmikroskopi kan användas för att analysera och kvantifiera polar tillväxt av A. nidulansstammar i både nedsänkta kulturer och fasta medier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Övervakning av svampcellstillväxt och fenotyp genom timelapsemikroskopi är ett kraftfullt tillvägagångssätt för att bedöma cellulärt beteende i realtid och kvantitativt och exakt avgöra om en viss läkemedelsbehandling och/ eller genetisk intervention resulterar i detekterbar celltillväxt eller fenotypiska skillnader över tiden.
I denna studie beskrevs en tillförlitlig live-cell imaging metodik för att mäta och kvantitativt analysera svamp utveckling, inklusive dynamiken i bakte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av projektet “A Greek Research Infrastructure for Visualizing and Monitoring Fundamental Biological Processes (BioImaging-GR)” (MIS 5002755) som genomförs inom ramen för åtgärden “Förstärkning av forsknings- och innovationsinfrastrukturen”, finansierad av det operativa programmet “Konkurrenskraft, entreprenörskap och innovation” (NSRF 2014–2020) och medfinansierat av Grekland och E. U.
Materials
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
References
- Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).
- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
- Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
- Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
- Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
- Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
- Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C. Fungal plasma membrane domains. FEMS Microbiology Reviews. , (2019).
- Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
- Bayram, &. #. 2. 1. 4. ;., Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
- Yu, J. -. H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
- Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
- Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
- Kasprowicz, R., Suman, R., O’Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
- Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
- Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
- Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
- Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).
- Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
- Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
- Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494 (2020).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, 2040-2048 (2009).
- Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).
- Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
- Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
- Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
- Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
- Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).
- Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -. H. Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
- Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
- Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).
