التحليل الكمي لمعدل نمو النيدولانات Aspergillus باستخدام المجهر الحي والبرمجيات مفتوحة المصدر
Summary
نحن نقدم بروتوكول التصوير الحي الخالي من التسمية باستخدام تقنيات المجهر الخفيفة المرسلة لالتقاط الصور وتحليل وقياس حركة النمو للفطريات الخيطية A. nidulans في كل من الثقافات المغمورة ووسائل الإعلام الصلبة. يمكن استخدام هذا البروتوكول بالتزامن مع المجهر الفلوري.
Abstract
ومن الثابت أن نمو مستعمرة من الفطريات الخيطية، تعتمد في الغالب على التغيرات في معدل النمو apical hyphae / mycelia، ويقدر بشكل كلي على وسائل الإعلام الصلبة من خلال مقارنة حجم المستعمرة. ومع ذلك ، لقياس كمي معدل نمو سلالات الفطريات المختلفة وراثيا أو سلالات في ظل ظروف بيئية / النمو المختلفة (درجة الحموضة ، ودرجة الحرارة ، ومصادر الكربون والنيتروجين ، والمضادات الحيوية ، وما إلى ذلك) أمر صعب. وهكذا، فإن السعي إلى اتباع نهج تكميلية لقياس حركة النمو يصبح إلزاميا من أجل فهم أفضل لنمو الخلايا الفطرية. وعلاوة على ذلك، فمن المعروف جيدا أن الفطريات الخيطية، بما في ذلك أسبيرغيلوس SPP.، لديها أنماط متميزة من النمو والتمايز في ظل ظروف شبه جوية على وسائل الإعلام الصلبة أو الثقافات المغمورة. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة مجهرية كمية لتحليل الحركية النمو من الفطريات نموذج Aspergillus nidulans، وذلك باستخدام التصوير الحي في كل من الثقافات المغمورة ووسائل الإعلام الصلبة. نحن نلتقط الصور ونحلل ونتحديد معدلات نمو السلالات الفطرية المختلفة بطريقة قابلة للاستنساخ وموثوقة باستخدام برمجيات مفتوحة المصدر ومجانية للصور الحيوية (مثل فيجي) ، بطريقة لا تتطلب أي خبرة سابقة في تحليل الصور من المستخدم.
Introduction
الفطريات الخيطية ذات أهمية اجتماعية واقتصادية وإيكولوجية كبيرة ، كونها حاسمة كأدوات صناعية / زراعية لإنتاج الإنزيمات والمضادات الحيوية1،2 وكعوامل ممرضة لنباتات المحاصيل3، حشرات الآفات4 والبشر3. وعلاوة على ذلك، تستخدم الفطريات الخيطية مثل النيدولان أسبيرغيلوس على نطاق واسع ككائنات نموذجية للبحوث الأساسية، مثل الدراسات في علم الوراثة والخلايا والبيولوجيا التطورية وكذلك لدراسة تمديد الواصلة5. الفطريات الخيطية هي كائنات شديدة الاستقطاب التي استطالة من خلال العرض المستمر من الدهون الغشائية / البروتينات وتوليف دي نوفو من جدار الخلية في طرف تمديد6. دور مركزي في نمو طرف الواصلة وصيانة القطبية هو هيكل متخصص يسمى ‘Spitzenkorper’ (SPK) ، وهو هيكل مرتبة للغاية تتكون في معظمها من مكونات الهيكل الخلوي والتوزيع المستقطب من غولجي6،7،8.
المحفزات البيئية / الإشارات، مثل هذه الواجهة المياه والهواء، والضوء،تركيز ثاني أكسيد الكربون، والحالة الغذائية هي المسؤولة عن القرارات التنموية التي اتخذتها هذه القوالب9. في الثقافات المغمورة (السائل) يتم قمع تمايز النيدولان A. ويحدث النمو عن طريق استطالة طرف الواصلة6. خلال النمو النباتي ، تنبت الجراثيم اللاجنسية (كونيديا) عن طريق التمديد apical ، وتشكيل شبكة غير متمايزة من الخلايا الواصلة المترابطة ، والميسيليوم ، والتي قد تستمر في النمو إلى أجل غير مسمى طالما تتوفر العناصر الغذائية والفضاء. من ناحية أخرى ، على نصائح الواصلة وسائل الإعلام الصلبة استطالة وبعد فترة محددة من النمو النباتي (الكفاءة التنموية) ، ويبدأ التكاثر اللاجنسي وسيقان conidiophore الجوية تمتد من خلايا القدم المتخصصة من الميسيليوم6. هذه تؤدي إلى هياكل متعددة الخلايا التنموية المتخصصة تسمى conidiophores، والتي تنتج سلاسل طويلة من haploid كونيديا10 التي يمكن أن تستأنف النمو في ظل ظروف بيئية مواتية.
وهناك طريقة تستخدم على نطاق واسع لقياس النمو الفطري الخيطي هو تطعيم الجراثيم على أجار المغذيات الواردة في طبق بيتري وقياس قطر المستعمرة بالمنظار بعد بضعة أيام11. القطر / منطقة المستعمرة ، والأكثر اعتمادا على التغيرات في معدل النمو mycelial وأقل على كثافة conidiophore12، ثم يستخدم كقيمة للنمو. على الرغم من أن قياس حجم السكان الفطرية (مستعمرة) تنمو على الأسطح الصلبة كافية جدا، فإنه ليس بأي حال من الأحوال مقياس الأكثر دقة للنمو. بالمقارنة مع متوسطات مستوى السكان (متوسطات حجم المستعمرة الفطرية) ، يمكن أن تلتقط قياسات الخلية الواحدة عدم التجانس في مجموعة الخلايا وتسمح بتحديد المجموعات الفرعية الجديدة من الخلايا ، والدول13، والديناميات ، والمسارات ، وكذلك الآليات البيولوجية التي تستجيب بها الخلايا للتغيرات الذاتية والبيئية14،15. يمكن القول إن رصد نمو الخلايا الفطرية والنمط الظاهري عن طريق المجهر الفاصل الزمني هو النهج الكمي الأكثر استخداما لمراقبة الخلايا المفردة.
هنا، نقوم بتفصيل بروتوكول التصوير الحي الخالي من التسميات باستخدام تقنيات المجهر الخفيفة المرسلة (مثل تباين المرحلة، وتباين التداخل التفاضلي (DIC)، والتنظير المجهري المستقطب) لالتقاط الصور، والتي يمكن استخدامها بشكل مستقل عن الاستخدام المشترك للتنظير المجهري الفلوري لتحليل وقياس النمو القطبي لسلالات النيدولان A. في كل من الثقافات المغمورة والوسائط الصلبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
مراقبة نمو الخلايا الفطرية والنمط الظاهري عن طريق المجهر الفاصل الزمني هو نهج قوي لتقييم السلوك الخلوي في الوقت الحقيقي وكميا ودقيقا تحديد ما إذا كان علاج المخدرات معينة و / أو التدخل الجيني يؤدي إلى نمو الخلايا التي يمكن الكشف عنها أو الاختلافات الظاهري مع مرور الوقت.
في ه?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل جزئيا مشروع “بنية تحتية للبحوث اليونانية لتصور ورصد العمليات البيولوجية الأساسية (BioImaging-GR)” (MIS 5002755) الذي ينفذ في إطار عمل “تعزيز البنية التحتية للبحوث والابتكار”، بتمويل من البرنامج التشغيلي “القدرة التنافسية وريادة الأعمال والابتكار” (NSRF 2014-2020) والذي تشارك في تمويله اليونان والاتحاد الأوروبي.
Materials
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
References
- Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).
- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
- Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
- Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
- Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
- Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
- Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C. Fungal plasma membrane domains. FEMS Microbiology Reviews. , (2019).
- Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
- Bayram, &. #. 2. 1. 4. ;., Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
- Yu, J. -. H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
- Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
- Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
- Kasprowicz, R., Suman, R., O’Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
- Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
- Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
- Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
- Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).
- Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
- Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
- Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494 (2020).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, 2040-2048 (2009).
- Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).
- Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
- Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
- Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
- Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
- Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).
- Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -. H. Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
- Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
- Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).
