Denne protokol beskriver en effektiv metode til at adskille spyt i en enkelt celle suspension og den efterfølgende karakterisering af cellulære delmængder på standard flow cytometriske platforme.
Sputum, der i vid udstrækning anvendes til at studere det cellulære indhold og andre mikromiljøfunktioner for at forstå lungens sundhed, analyseres traditionelt ved hjælp af cytologibaserede metoder. Dens nytte er begrænset, fordi læsning af dias er tidskrævende og kræver højt specialiseret personale. Desuden gør omfattende snavs og tilstedeværelsen af for mange pladeformede epitelceller (SECs) eller kindceller ofte en prøve utilstrækkelig til diagnose. I modsætning hertil giver flowcytometri mulighed for fænotyping med høj gennemløb af cellulære populationer, samtidig med at snavs og 2-metri’er udelukkes.
Protokollen præsenteres her beskriver en effektiv metode til at adskille spyt i en enkelt celle suspension, antistof plet og fastsætte cellulære populationer, og erhverve prøver på en flow cytometri platform. En gating strategi, der beskriver udelukkelse af vragrester, døde celler (herunder SECs) og celle doublets præsenteres her. Endvidere forklarer dette arbejde også, hvordan man analyserer levedygtige, enkelte spytceller baseret på en klynge af differentiering (CD)45 positive og negative populationer for at karakterisere hæmatoopoietiske og epitelstrenge subsets. En kvalitetskontrol foranstaltning er også fastsat ved at identificere lunge-specifikke makrofager som bevis for, at en prøve er afledt af lungen og er ikke spyt. Endelig er det blevet påvist, at denne metode kan anvendes på forskellige cytometriske platforme ved at levere spytprofiler fra den samme patient analyseret på tre flowcytometre; Navios EX, LSR II og Lyric. Desuden kan denne protokol ændres til at omfatte yderligere cellulære markører af interesse. En metode til at analysere en hel spytprøve på en flowcytometrisk platform præsenteres her, der gør spyt modtagelig for udvikling af høj-throughput diagnostik af lungesygdom.
Tekniske fremskridt inden for hardware og software af flowcytometre har gjort det muligt at identificere mange forskellige cellepopulationer samtidigt1,2,3,4. Udnyttelsen af flowcytometeret i hæmatoopoietisk celleforskning har for eksempel ført til en langt bedre forståelse af immunsystemet2 og det cellulære hierarki i det hæmatoopoietiske system5 samt den diagnostiske sondring af en lang række forskellige blodkræft6,7,8. Selv om de fleste spytceller er af hæmatopoietisk oprindelse9,10,11, flow cytometri har ikke været almindeligt anvendt til spyt analyse til diagnostiske formål. Men, flere undersøgelser tyder på, at evalueringen af immuncellepopulationer i spyt (den mest betydningsfulde delmængde af celler) kan være til stor hjælp i diagnosticering og / eller overvågning af sygdomme som astma og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL)12,13,14,15. Desuden tillader eksistensen af epitelspecifikke markører, der kan bruges i flowcytometri, forhør af følgende mest betydningsfulde delmængde af celler i spyt, lungeepileleceller.
Ud over evnen til at analysere mange forskellige cellepopulationer af forskellig vævsoprindelse kan et flowcytometer evaluere et stort antal celler på relativt kort tid. Til sammenligning kræver diasbaserede, cytologiske typer analyser ofte højt specialiseret personale og/eller udstyr. Disse analyser kan være arbejdskrævende, hvilket fører til, at kun en del af spytprøven analyseres16.
Tre kritiske spørgsmål begrænser den udbredte brug af spyt i flowcytometri. Det første nummer vedrører indsamlingen af spyt. Spyt opsamles gennem en huff hoste, der udviser slim fra lungerne ind i mundhulen, efterfølgende spytte ind i en samling kop. Da slim rejser gennem mundhulen, er der en stor chance for SEC forurening. Denne forurening komplicerer prøveanalysen, men problemet afhjælpes let på en flowcytometrisk platform, som vist i denne undersøgelse.
Ikke alle kan producere spyt spontant; derfor er der udviklet flere enheder til at hjælpe med spytsamlingen på en ikke-invasiv måde17. Forstøveren er en sådan anordning og har vist sig at producere pålidelige spytprøver18,19,20. Selv om forstøveren er en meget effektiv måde at ikke-invasivt indsamling spyt, dens anvendelse stadig kræver en indstilling på en medicinsk facilitet med specialiseret personale21. I modsætning hertil kan håndholdte enheder som lungefløjten22, 23,24 og acapella16,25 bruges hjemme, da de er meget brugervenlige. Disse hjælpeenheder er både sikre og omkostningseffektive.
For os gav acapella konsekvent bedre resultater end lungefløjten16, og derfor er acapella-enheden valgt til spytsamlinger. En 3-dages indsamling prøve blev besluttet, fordi det primære formål med at bruge spyt er at udvikle en lungekræft afsløring test16. Det har vist sig, at en 3-dages prøve øger sandsynligheden for lungekræft afsløring i forhold til en 1- eller 2-dages prøve26,27,28. Andre metoder til sputumindsamling kan dog være at foretrække til forskellige formål. Hvis der anvendes en anden spytsamlingsmetode end den, der er beskrevet her, anbefales det omhyggeligt at titrere hvert antistof eller farvestof, der anvendes til flowcytometrianalyse; meget få data er tilgængelige om, hvordan forskellige spyt indsamling metoder påvirker de målrettede proteiner til flow cytometri.
Det andet spørgsmål, der dæmper begejstringen for at bruge spyt til diagnostik, primært relateret til flowcytometri, er cellenummer. Problemet er indsamlingen af tilstrækkelige levedygtige celler til en pålidelig analyse. To undersøgelser viste, at spytprøver indsamlet ved ikke-invasive metoder, ved hjælp af en hjælpeanordning, indeholder nok levedygtige celler, der kan udnyttes i klinisk diagnose eller forskningsundersøgelser16,24. Ingen af disse undersøgelser omhandlede imidlertid spørgsmålet om celletal vedrørende flowcytometri.
For de undersøgelser, der danner grundlag for denne protokol, sputum prøver blev indsamlet fra deltagere med høj risiko for at udvikle lungekræft efter godkendte institutionelle retningslinjer for hvert studiested. Højrisikodeltagere blev defineret som mellem 55-75 år, efter at have røget 30 pakkeår og ikke har holdt op med at ryge inden for de sidste 15 år. Patienterne blev vist, hvordan man bruger acapella-enheden i henhold til producentens anvisninger29 og indsamlede spyt i tre på hinanden følgende dage derhjemme. Prøven blev opbevaret i køleskabet indtil den sidste samling. På den sidste indsamlingsdag blev prøven sendt til laboratoriet natten over med en frossen kold pakke. Prøverne blev behandlet til en enkelt celle suspension den dag, de blev modtaget. Med denne metode til sputumsamling opnås mere end nok levedygtige celler til en pålidelig flowcytometrisk analyse.
Endelig, og relateret til den tidligere celle nummer spørgsmål, er spørgsmålet om, hvordan man frigiver spytceller fra sin mucinøse miljø. Hvordan kan cellerne holdes levedygtige og skabe en enkelt celle suspension, der ikke tilstopper strømmen cytometer? Baseret på indledende arbejde af Pizzichini et al.30 og Miller et al.31, beskriver denne protokol en nem og pålidelig metode til spyt behandling i en enkelt celle suspension, der er egnet til flow cytometrisk analyse. Denne metode har anvendt veletablerede retningslinjer i flowcytometri32,33,34 til at udvikle en effektiv antistofmærkningsstrategi til at identificere hæmatopoietiske og epitelceller i spyt og give instrumentindstillinger, kvalitetskontrolforanstaltninger og analyseretningslinjer, der standardiserer spytanalyse på en flowcytometrisk platform.
Det cellulære indhold af spyt omfatter et stort udvalg af vidtrækkende celler, ofte ledsaget af en masse snavs37. Derudover kræver spytanalyse en kvalitetskontrol, der bekræfter, at prøven indsamles fra lungen i stedet for mundhulen38. Derfor er det ikke så simpelt at analysere spyt ved flowcytometri som det er for blod, for eksempel, hvilket frigiver en meget renere og homogen celleaffjedring. Denne protokol har behandlet alle disse spørgsmål: at give instrumentind…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke David Rodriguez for hans hjælp med figurforberedelsen. Sputum prøver blev kørt på BD LSR II på UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, støttet af UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC på UT Health) og UL1 TR001120 (CTSA tilskud).
1% Paraformaldehyde Flow-Fix | Polysciences | 25037 | |
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360 | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
3 M NaOH | EMD | SX0593-1 | |
50 mL conical falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Alexa488 anti-human CD19 | BioLegend | 302219 | |
Alexa488 anti-human CD3 | BioLegend | 300415 | |
Alexa488 anti-human cytokeratin | BioLegend | 628608 | |
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype | BioLegend | 400129 | |
BV510 anti-human CD45 | BioLegend | 304036 | |
CD66b FITC isotype | BD Biosciences | 555748 | |
CompBead Plus Compensation Beads | BD Biosciences | 560497 | |
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL | Fisher Scientific | 09-761-4 | |
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL | Fisher Scientific | 09-761-10 | |
CS&T beads | BD Biosciences | 655051 | |
DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
FITC anti-human CD66b | GeneTex | GTX75907 | |
Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 564406 | |
FlowCheck | Beckman Coulter | A69183 | |
FlowSet | Beckman Coulter | A69184 | |
HBSS | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
NAC | Sigma-Aldrich | A9165 | |
NIST Beads, 05 μM | Polysciences | 64080 | |
NIST Beads, 20 μM | Polysciences | 64160 | |
NIST Beads, 30 μM | Polysciences | 64170 | |
PE anti-human CD45 | BioLegend | 304039 | |
PE-CF594 anti-human EpCAM | BD Biosciences | 565399 | |
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype | BD Biosciences | 562292 | |
PE-CR594 anti-human CD206 | BD Biosciences | 564063 | |
Sodium citrate dihydrate | EMD | SX0445-1 | |
Trypan Blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 |