Qualitätskontrollierte Sputumanalyse mittels Durchflusszytometrie

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Dissoziation von Sputum in eine einzelne Zellsuspension und die anschließende Charakterisierung zellulärer Untergruppen auf Standard-Durchflusszytometrieplattformen.

Abstract

Sputum, weit verbreitet, um den zellulären Inhalt und andere mikroumweltliche Merkmale zu untersuchen, um die Gesundheit der Lunge zu verstehen, wird traditionell mit zytologischen Methoden analysiert. Sein Nutzen ist begrenzt, da das Lesen der Folien zeitaufwendig ist und hochspezialisiertes Personal erfordert. Darüber hinaus machen ausgedehnte Trümmer und das Vorhandensein von zu vielen Plattenepithelzellen (SECs) oder Wangenzellen eine Probe oft für die Diagnose ungeeignet. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Durchflusszytometrie eine Hochdurchsatz-Phänotypisierung zellulärer Populationen bei gleichzeitigem Ausschluss von Trümmern und SECs.

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine effiziente Methode, um Sputum in eine einzelne Zellsuspension zu dissoziieren, Antikörper zu färben und zelluläre Populationen zu fixieren und Proben auf einer durchflusszytometrischen Plattform zu entnehmen. Eine Gating-Strategie, die den Ausschluss von Trümmern, toten Zellen (einschließlich SECs) und Zelldouletten beschreibt, wird hier vorgestellt. Darüber hinaus erklärt diese Arbeit auch, wie lebensfähige, einzelne Sputumzellen basierend auf einem Cluster von Differenzierungspopulationen (CD) 45 positiven und negativen Populationen analysiert werden können, um hämatopoetische und epitheliale Abstammungsuntergruppen zu charakterisieren. Eine Qualitätskontrollmaßnahme wird auch durch die Identifizierung lungenspezifischer Makrophagen als Beweis dafür bereitgestellt, dass eine Probe aus der Lunge stammt und kein Speichel ist. Schließlich wurde gezeigt, dass diese Methode auf verschiedene zytometrische Plattformen angewendet werden kann, indem Sputumprofile desselben Patienten bereitgestellt werden, die auf drei Durchflusszytometern analysiert wurden. Navios EX, LSR II und Lyric. Darüber hinaus kann dieses Protokoll modifiziert werden, um zusätzliche zelluläre Marker von Interesse aufzunehmen. Hier wird eine Methode zur Analyse einer gesamten Sputumprobe auf einer durchflusszytometrischen Plattform vorgestellt, die Sputum für die Entwicklung einer Hochdurchsatzdiagnostik von Lungenerkrankungen geeignet macht.

Introduction

Technische Fortschritte in der Hard- und Software von Durchflusszytometern haben es ermöglicht, viele verschiedene Zellpopulationen gleichzeitig zu identifizieren1,2,3,4. Der Einsatz des Durchflusszytometers in der hämatopoetischen Zellforschung hat beispielsweise zu einem viel besseren Verständnis des ^{Immunsystems2} und der zellulären Hierarchie des hämatopoetischen ^Systems5 sowie zur diagnostischen Unterscheidung einer Vielzahl verschiedener Blutkrebsarten ^{geführt6,7,8}. Obwohl die meisten Sputumzellen hämatopoetischen Ursprungs sind9,10,11, wurde die Durchflusszytometrie nicht weit verbreitet für die Sputumanalyse zu diagnostischen Zwecken eingesetzt. Mehrere Studien deuten jedoch darauf hin, dass die Bewertung von Immunzellpopulationen im Sputum (der bedeutendsten Untergruppe von Zellen) eine große Hilfe bei der Diagnose und / oder Überwachung von Krankheiten wie Asthma und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) sein kann 12,13,14,15. Darüber hinaus ermöglicht die Existenz von epithelspezifischen Markern, die in der Durchflusszytometrie verwendet werden können, die Abfrage der folgenden signifikantesten Untergruppe von Zellen im Sputum, Lungenepithelzellen.

Neben der Fähigkeit, viele verschiedene Zellpopulationen unterschiedlicher Gewebeherkunft zu analysieren, kann ein Durchflusszytometer eine große Anzahl von Zellen in relativ kurzer Zeit auswerten. Im Vergleich dazu erfordern folienbasierte, zytologische Analysen oft hochspezialisiertes Personal und/oder Equipment. Diese Analysen können arbeitsintensiv sein, was dazu führt, dass nur ein Teil der Sputumprobe analysiert ^wird16.

Drei kritische Punkte begrenzen die weit verbreitete Verwendung von Sputum in der Durchflusszytometrie. Die erste Frage bezieht sich auf die Sammlung von Sputum. Sputum wird durch einen Huff-Husten gesammelt, der Schleim aus der Lunge in die Mundhöhle ausstößt und anschließend in einen Sammelbecher spuckt. Da der Schleim durch die Mundhöhle wandert, besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit einer SEC-Kontamination. Diese Kontamination erschwert die Probenanalyse, aber das Problem kann leicht auf einer durchflusszytometrischen Plattform behoben werden, wie in dieser Studie gezeigt.

Nicht jeder kann spontan Sputum produzieren; Daher wurden mehrere Geräte entwickelt, um die Sputumsammlung auf nicht-invasive Weise zu ^{unterstützen17}. Der Vernebler ist ein solches Gerät und produziert nachweislich zuverlässige Auswurfproben18,19,20. Obwohl der Vernebler eine sehr effektive Möglichkeit ist, Sputum nicht-invasiv zu sammeln, erfordert seine Verwendung immer noch eine Einstellung in einer medizinischen Einrichtung mit spezialisiertem ^Personal21. Im Gegensatz dazu können Handheld-Geräte wie die ^{Lungenflöte22,23,24} und die acapella16,25 zu Hause verwendet werden, da sie sehr benutzerfreundlich sind. Diese Assistenzgeräte sind sowohl sicher als auch kostengünstig.

Für uns lieferte die Acapella durchweg bessere Ergebnisse als die ^{Lungenflöte16}, und daher wurde das Acapella-Gerät für Sputumsammlungen ausgewählt. Eine 3-tägige Entnahmeprobe wurde beschlossen, da der Hauptzweck für die Verwendung von Sputum darin besteht, einen Lungenkrebserkennungstest zu ^entwickeln16. Es hat sich gezeigt, dass eine 3-Tage-Probe die Wahrscheinlichkeit der Lungenkrebserkennung im Vergleich zu einer 1- oder 2-Tage-Probe erhöht26,27,28. Andere Methoden der Sputumsammlung können jedoch für verschiedene Zwecke vorzuziehen sein. Wenn eine andere Sputumsammelmethode als die hier beschriebene verwendet wird, wird empfohlen, jeden Antikörper oder Farbstoff, der für die durchflusszytometrische Analyse verwendet wird, sorgfältig zu titrieren. Es liegen nur sehr wenige Daten darüber vor, wie sich verschiedene Sputumsammelmethoden auf die Zielproteine für die Durchflusszytometrie auswirken.

Das zweite Thema, das die Begeisterung für die Verwendung von Sputum für die Diagnostik dämpft, vor allem im Zusammenhang mit der Durchflusszytometrie, ist die Zellzahl. Das Problem ist die Sammlung von ausreichend lebensfähigen Zellen für eine zuverlässige Analyse. Zwei Studien zeigten, dass Sputumproben, die mit hilfe eines Hilfsgeräts mit nicht-invasiven Methoden entnommen wurden, genügend lebensfähige Zellen enthalten, die in klinischen Diagnose- oder Forschungsstudien verwendet werden ^können16,24. Keine dieser Studien befasste sich jedoch mit der Frage der Zellzahlen in Bezug auf die Durchflusszytometrie.

Für die Studien, die die Grundlage für dieses Protokoll bilden, wurden Sputumproben von Teilnehmern mit hohem Risiko für die Entwicklung von Lungenkrebs nach genehmigten institutionellen Richtlinien für jeden Studienstandort gesammelt. Hochrisikoteilnehmer wurden als zwischen 55 und 75 Jahren definiert, nachdem sie 30 Packungsjahre geraucht und in den letzten 15 Jahren nicht mit dem Rauchen aufgehört hatten. Den Patienten wurde gezeigt, wie sie das Acapella-Gerät gemäß den Anweisungen des ^{Herstellers29} verwenden und Sputum an drei aufeinanderfolgenden Tagen zu Hause sammelten. Die Probe wurde bis zur letzten Entnahme im Kühlschrank aufbewahrt. Am letzten Abholtag wurde die Probe über Nacht mit einer gefrorenen Kühlpackung ins Labor geschickt. Die Proben wurden am Tag ihres Eingangs zu einer einzelnen Zellsuspension verarbeitet. Mit dieser Methode der Sputumgewinnung werden mehr als genug lebensfähige Zellen für eine zuverlässige durchflusszytometrische Analyse gewonnen.

Schließlich, und im Zusammenhang mit dem vorherigen Problem der Zellzahl, stellt sich die Frage, wie die Sputumzellen aus ihrer muzinösen Umgebung freigesetzt werden können. Wie können die Zellen lebensfähig gehalten werden und eine einzelne Zellsuspension erzeugen, die das Durchflusszytometer nicht verstopft? Basierend auf ersten Arbeiten von Pizzichini et ^al.30 und Miller et ^al.31 beschreibt dieses Protokoll eine einfache und zuverlässige Methode zur Sputumverarbeitung zu einer Einzelzellsuspension, die für die durchflusszytometrische Analyse geeignet ist. Diese Methode hat etablierte Richtlinien in der Durchflusszytometrie32,33,34 verwendet^, um eine effiziente Antikörpermarkierungsstrategie zu entwickeln, um hämatopoetische und epitheliale Zellen im Sputum zu identifizieren und Instrumenteneinstellungen, Qualitätskontrollmaßnahmen und Analyserichtlinien bereitzustellen, die die Sputumanalyse auf einer durchflusszytometrischen Plattform standardisieren.

Protocol

Alle Schritte der Sputumaufbereitung werden in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt. 1. Reagenzienvorbereitung vor Beginn der Sputumdissoziation 1% Paraformaldehyd (PFA), 25 ml pro Probe auf Eis auftauen und bis zum Gebrauch kalt aufbewahren.VORSICHT: PFA ist giftig durch Einatmen und Hautkontakt. Bereiten Sie das Fixiermittel gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und frieren Sie es bei -20 °C in 25 ml Aliq…

Representative Results

Dieses Protokoll wurde mit Blick auf ein klinisches Labor entwickelt. Der Fokus bei der Entwicklung des Protokolls lag auf Einfachheit, Effizienz und Reproduzierbarkeit. Es wurde festgestellt, dass der zeitaufwendigste Schritt bei der Verarbeitung von Sputum das Zählen der Zellen war. Daher ist das Protokoll so aufgebaut, dass die Sputumverarbeitung und Zellmarkierung unabhängig von der Zellzählung ohne Zeitverlust durchgeführt werden kann. Eine genaue Zellzahl, die immer noch notwendig ist, um die Probe für einen u…

Discussion

Der zelluläre Gehalt des Sputums umfasst eine Vielzahl von weit reichenden Zellen, oft begleitet von vielen ^Trümmern37. Darüber hinaus erfordert die Sputumanalyse eine Qualitätskontrolle, die bestätigt, dass die Probe aus der Lunge und nicht aus der Mundhöhle entnommen ^wird38. Daher ist es nicht so einfach, Sputum mittels Durchflusszytometrie zu analysieren, wie es beispielsweise bei Blut der Fall ist, das eine viel sauberere und homogenere Zellsuspension freisetzt. D…

Materials

1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061