फ्लो साइटोमेट्री द्वारा गुणवत्ता-नियंत्रित थूक विश्लेषण
Summary
यह प्रोटोकॉल एक एकल सेल निलंबन में थूक को अलग करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है और मानक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफार्मों पर सेलुलर सबसेट के बाद के लक्षण वर्णन का वर्णन करता है।
Abstract
थूक, व्यापक रूप से फेफड़ों के स्वास्थ्य को समझने के लिए सेलुलर सामग्री और अन्य माइक्रोएनवायरमेंटल विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, पारंपरिक रूप से साइटोलॉजी-आधारित तरीकों का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है। इसकी उपयोगिता सीमित है क्योंकि स्लाइड पढ़ना समय लेने वाला है और इसके लिए अत्यधिक विशिष्ट कर्मियों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, व्यापक मलबे और बहुत अधिक स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं (एसईसी), या गाल कोशिकाओं की उपस्थिति, अक्सर निदान के लिए अपर्याप्त नमूना प्रदान करती है। इसके विपरीत, फ्लो साइटोमेट्री सेलुलर आबादी के उच्च-थ्रूपुट फेनोटाइपिंग के लिए अनुमति देता है, जबकि एक साथ मलबे और एसईसी को छोड़कर।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक एकल सेल निलंबन, एंटीबॉडी दाग और सेलुलर आबादी को ठीक करने और एक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफॉर्म पर नमूने प्राप्त करने के लिए थूक को अलग करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है। एक गेटिंग रणनीति जो मलबे, मृत कोशिकाओं (एसईसी सहित) और सेल डबल्स के बहिष्करण का वर्णन करती है, यहां प्रस्तुत की गई है। इसके अलावा, यह काम यह भी बताता है कि हेमटोपोइएटिक और उपकला वंश के सबसेट को चिह्नित करने के लिए भेदभाव (सीडी) 45 सकारात्मक और नकारात्मक आबादी के एक समूह के आधार पर व्यवहार्य, एकल थूक कोशिकाओं का विश्लेषण कैसे किया जाए। एक गुणवत्ता नियंत्रण उपाय भी सबूत के रूप में फेफड़ों-विशिष्ट मैक्रोफेज की पहचान करके प्रदान किया जाता है कि एक नमूना फेफड़ों से प्राप्त होता है और लार नहीं होता है। अंत में, यह प्रदर्शित किया गया है कि इस विधि को तीन प्रवाह साइटोमीटर पर विश्लेषण किए गए एक ही रोगी से थूक प्रोफाइल प्रदान करके विभिन्न साइटोमेट्रिक प्लेटफार्मों पर लागू किया जा सकता है; Navios पूर्व, LSR द्वितीय, और गीत. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को ब्याज के अतिरिक्त सेलुलर मार्करों को शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। एक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफ़ॉर्म पर एक पूरे थूक के नमूने का विश्लेषण करने के लिए एक विधि यहां प्रस्तुत की गई है जो थूक को फेफड़ों की बीमारी के उच्च-थ्रूपुट निदान के विकास के लिए उपयुक्त बनाती है।
Introduction
प्रवाह साइटोमीटर के हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर में तकनीकी प्रगति ने एक साथ कई अलग-अलग सेल आबादी की पहचान करना संभव बना दिया है1,2,3,4। हेमटोपोइएटिक सेल अनुसंधान में प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग, उदाहरण के लिए, प्रतिरक्षा प्रणाली 2 और हेमटोपोइएटिक सिस्टम 5 के सेलुलर पदानुक्रम की बेहतर समझ के साथ-साथ विभिन्न रक्त कैंसर की भीड़ के नैदानिक अंतर को जन्म दिया है6,7,8। यद्यपि अधिकांश थूक कोशिकाएं हेमटोपोइएटिक मूल की हैं9,10,11, फ्लो साइटोमेट्री को नैदानिक उद्देश्यों के लिए थूक विश्लेषण पर व्यापक रूप से लागू नहीं किया गया है। हालांकि, कई अध्ययनों से पता चलता है कि थूक (कोशिकाओं का सबसे महत्वपूर्ण सबसेट) में प्रतिरक्षा कोशिका आबादी का मूल्यांकन अस्थमा और क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी) 12,13,14,15 जैसी बीमारियों के निदान और / या निगरानी में बहुत मदद कर सकता है। इसके अलावा, उपकला-विशिष्ट मार्करों का अस्तित्व जो प्रवाह साइटोमेट्री में उपयोग किया जा सकता है, थूक, फेफड़ों की उपकला कोशिकाओं में कोशिकाओं के निम्नलिखित सबसे महत्वपूर्ण सबसेट की पूछताछ की अनुमति देता है।
विभिन्न ऊतक मूल के कई अलग-अलग सेल आबादी का विश्लेषण करने की क्षमता के अलावा, एक प्रवाह साइटोमीटर अपेक्षाकृत कम अवधि में बड़ी संख्या में कोशिकाओं का मूल्यांकन कर सकता है। इसकी तुलना में, स्लाइड-आधारित, साइटोलॉजिकल प्रकार के विश्लेषणों के लिए अक्सर अत्यधिक विशिष्ट कर्मियों और / या उपकरणों की आवश्यकता होती है। ये विश्लेषण श्रम-गहन हो सकते हैं, जो थूक के नमूने का केवल एक अनुपात विश्लेषण किया जा रहा है16 की ओर जाता है।
तीन महत्वपूर्ण मुद्दे प्रवाह साइटोमेट्री में थूक के व्यापक उपयोग को सीमित करते हैं। पहला मुद्दा थूक के संग्रह से संबंधित है। थूक को एक हफ खांसी के माध्यम से एकत्र किया जाता है जो फेफड़ों से बलगम को मौखिक गुहा में निष्कासित करता है, बाद में एक संग्रह कप में थूकता है। चूंकि बलगम मौखिक गुहा के माध्यम से यात्रा करता है, इसलिए एसईसी संदूषण की एक उच्च संभावना है। यह संदूषण नमूना विश्लेषण को जटिल बनाता है, लेकिन समस्या को आसानी से एक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफॉर्म पर ठीक कर दिया जाता है, जैसा कि इस अध्ययन में दिखाया गया है।
हर कोई अनायास थूक का उत्पादन नहीं कर सकता है; इसलिए, कई उपकरणों को एक गैर-आक्रामक तरीके से थूक संग्रह के साथ सहायता करने के लिए विकसित किया गया है17। नेबुलाइज़र एक ऐसा उपकरण है और इसे विश्वसनीय थूक के नमूनों का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है18,19,20। हालांकि नेबुलाइज़र गैर-आक्रामक रूप से थूक एकत्र करने का एक बहुत ही प्रभावी तरीका है, इसके उपयोग के लिए अभी भी विशेष कर्मियों के साथ एक चिकित्सा सुविधा में एक सेटिंग की आवश्यकता होती है21। इसके विपरीत, फेफड़ों की बांसुरी 22,23,24 और एकापेला 16,25 जैसे हैंडहेल्ड उपकरणों का उपयोग घर पर किया जा सकता है क्योंकि वे बहुत उपयोगकर्ता के अनुकूल हैं। ये सहायता उपकरण दोनों सुरक्षित और लागत प्रभावी हैं।
हमारे लिए, अकापेला ने फेफड़ों की बांसुरी 16 की तुलना में लगातार बेहतर परिणाम दिए, और इसलिए, एकापेला डिवाइस को थूक संग्रह के लिए चुना गया है। एक 3-दिवसीय संग्रह नमूना तय किया गया था क्योंकि थूक का उपयोग करने का प्राथमिक उद्देश्य फेफड़ों के कैंसर का पता लगाने वाले परीक्षण 16 को विकसित करना है। यह दिखाया गया है कि 3-दिवसीय नमूना 1- या 2-दिवसीय नमूने 26,27,28 की तुलना में फेफड़ों के कैंसर का पता लगाने की संभावना को बढ़ाता है। हालांकि, थूक संग्रह के अन्य तरीके विभिन्न उद्देश्यों के लिए बेहतर हो सकते हैं। यदि यहां वर्णित एक की तुलना में एक अलग थूक संग्रह विधि का उपयोग किया जाता है, तो प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक एंटीबॉडी या डाई को सावधानीपूर्वक टाइटरेट करने की सिफारिश की जाती है; बहुत कम डेटा उपलब्ध है कि विभिन्न थूक संग्रह विधियां प्रवाह साइटोमेट्री के लिए लक्षित प्रोटीन को कैसे प्रभावित करती हैं।
निदान के लिए थूक का उपयोग करने के लिए उत्साह को कम करने वाला दूसरा मुद्दा, मुख्य रूप से प्रवाह साइटोमेट्री से संबंधित है, सेल संख्या है। समस्या एक विश्वसनीय विश्लेषण के लिए पर्याप्त व्यवहार्य कोशिकाओं का संग्रह है। दो अध्ययनों से पता चला है कि गैर-इनवेसिव तरीकों द्वारा एकत्र किए गए थूक के नमूनों में, एक सहायता उपकरण की मदद से, पर्याप्त व्यवहार्य कोशिकाएं होती हैं जिनका उपयोग नैदानिक निदान या अनुसंधान अध्ययनों में किया जा सकता है16,24। हालांकि, इन अध्ययनों में से किसी ने भी प्रवाह साइटोमेट्री से संबंधित सेल संख्याओं के मुद्दे को संबोधित नहीं किया।
इस प्रोटोकॉल के लिए आधार बनाने वाले अध्ययनों के लिए, प्रत्येक अध्ययन स्थल के लिए अनुमोदित संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करते हुए फेफड़ों के कैंसर के विकास के लिए उच्च जोखिम वाले प्रतिभागियों से थूक के नमूने एकत्र किए गए थे। उच्च जोखिम वाले प्रतिभागियों को 55-75 वर्षों के बीच के रूप में परिभाषित किया गया था, जिन्होंने 30 पैक-वर्षों में धूम्रपान किया था और पिछले 15 वर्षों के भीतर धूम्रपान नहीं छोड़ा था। रोगियों को दिखाया गया था कि निर्माता के निर्देशों के अनुसार एकापेला डिवाइस का उपयोग कैसे किया जाए29 और घर पर लगातार तीन दिनों तक थूक एकत्र किया गया। नमूने को अंतिम संग्रह तक रेफ्रिजरेटर में रखा गया था। अंतिम संग्रह के दिन, नमूने को एक जमे हुए ठंडे पैक के साथ रात भर प्रयोगशाला में भेज दिया गया था। नमूनों को उस दिन एक एकल सेल निलंबन में संसाधित किया गया था जिस दिन वे प्राप्त हुए थे। थूक संग्रह की इस विधि के साथ, एक विश्वसनीय प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए पर्याप्त व्यवहार्य कोशिकाओं से अधिक प्राप्त किया जाता है।
अंत में, और पिछले सेल नंबर मुद्दे से संबंधित, यह सवाल है कि थूक कोशिकाओं को इसके म्यूकिनस वातावरण से कैसे जारी किया जाए। कोशिकाओं को व्यवहार्य कैसे रखा जा सकता है और एक एकल सेल निलंबन बनाया जा सकता है जो प्रवाह साइटोमीटर को रोक नहींता है? Pizzichini et al.30 और Miller et al.31 द्वारा प्रारंभिक काम के आधार पर, यह प्रोटोकॉल एक एकल सेल निलंबन में थूक प्रसंस्करण के लिए एक आसान और विश्वसनीय विधि का वर्णन करता है जो प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त है। इस विधि ने थूक में हेमटोपोइएटिक और उपकला कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एक कुशल एंटीबॉडी लेबलिंग रणनीति विकसित करने और एक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफॉर्म पर थूक विश्लेषण को मानकीकृत करने वाले उपकरण सेटिंग्स, गुणवत्ता नियंत्रण उपायों और विश्लेषण दिशानिर्देशों को प्रदान करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री 32,33,34 में अच्छी तरह से स्थापित दिशानिर्देशों का उपयोग किया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
थूक की सेलुलर सामग्री में व्यापक कोशिकाओं की एक बड़ी विविधता शामिल है, जो अक्सर बहुत सारे मलबे के साथ होती है37। इसके अलावा, थूक विश्लेषण के लिए एक गुणवत्ता नियंत्रण की आवश्यकता होती है जो पुष्ट…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम आंकड़े की तैयारी के साथ उनकी सहायता के लिए डेविड रोड्रिगेज को धन्यवाद देना चाहते हैं। थूक के नमूने यूटी हेल्थ सैन एंटोनियो फ्लो साइटोमेट्री साझा संसाधन सुविधा में बीडी एलएसआर II पर चलाए गए थे, जो यूटी हेल्थ, एनआईएच-एनसीआई पी 30 सीए054174-20 (यूटी हेल्थ में सीटीआरसी) और यूएल 1 टीआर 001120 (सीटीएसए अनुदान) द्वारा समर्थित था।
Materials
| 1% Paraformaldehyde Flow-Fix | Polysciences | 25037 | |
| 100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360 | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 3 M NaOH | EMD | SX0593-1 | |
| 50 mL conical falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Alexa488 anti-human CD19 | BioLegend | 302219 | |
| Alexa488 anti-human CD3 | BioLegend | 300415 | |
| Alexa488 anti-human cytokeratin | BioLegend | 628608 | |
| Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype | BioLegend | 400129 | |
| BV510 anti-human CD45 | BioLegend | 304036 | |
| CD66b FITC isotype | BD Biosciences | 555748 | |
| CompBead Plus Compensation Beads | BD Biosciences | 560497 | |
| Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL | Fisher Scientific | 09-761-4 | |
| Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL | Fisher Scientific | 09-761-10 | |
| CS&T beads | BD Biosciences | 655051 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| FITC anti-human CD66b | GeneTex | GTX75907 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 564406 | |
| FlowCheck | Beckman Coulter | A69183 | |
| FlowSet | Beckman Coulter | A69184 | |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| NAC | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NIST Beads, 05 μM | Polysciences | 64080 | |
| NIST Beads, 20 μM | Polysciences | 64160 | |
| NIST Beads, 30 μM | Polysciences | 64170 | |
| PE anti-human CD45 | BioLegend | 304039 | |
| PE-CF594 anti-human EpCAM | BD Biosciences | 565399 | |
| PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype | BD Biosciences | 562292 | |
| PE-CR594 anti-human CD206 | BD Biosciences | 564063 | |
| Sodium citrate dihydrate | EMD | SX0445-1 | |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 |
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