Zebrafish blastoderm explants genereras genom att isolera embryonala celler från endogena signalcentra inom det tidiga embryot, vilket producerar relativt naiva cellkluster som lätt manipuleras och odlas ex vivo. Den här artikeln innehåller instruktioner för att göra sådana explanter och demonstrerar deras användbarhet genom att förhöra roller för Nodal-signalering under gastrulation.
På grund av deras optiska klarhet och snabba utveckling är zebrafiskembryon ett utmärkt system för att undersöka cellbeteenden och utvecklingsprocesser. På grund av komplexiteten och redundansen av embryonala signaler kan det dock vara utmanande att urskilja den fullständiga rollen för en enda signal under tidig embryogenes. Genom att explantera djurregionen i zebrafisk blastoderm genereras relativt naiva kluster av embryonala celler som lätt kan odlas och manipuleras ex vivo. Genom att införa en gen av intresse genom RNA-injektion före explantation kan man bedöma effekten av denna molekyl på genuttryck, cellbeteenden och andra utvecklingsprocesser i relativ isolering. Dessutom kan celler från embryon av olika genotyper eller tillstånd kombineras i en enda chimerisk explant för att undersöka cell-/vävnadsinteraktioner och vävnadsspecifika genfunktioner. Denna artikel innehåller instruktioner för att generera zebrafisk blastoderm explants och visar att en enda signalmolekyl – en Nodal ligand – är tillräcklig för att inducera bakterie lager bildning och förlängning morphogenesis i annars naiva embryonala vävnader. På grund av deras förmåga att rekapitulera embryonala cellbeteenden, morfonagradienter och genuttrycksmönster i ett förenklat ex vivo-system, förväntas dessa explanter vara till stor nytta för många zebrafiskforskare.
Ett ständigt mål för utvecklingsbiologiområdet är att avslöja komplexiteten i att utveckla embryon för att förstå ursprunget till djurform och funktion. Även tidiga embryon innehåller ett komplext medley av signalmolekyler, cell- och vävnadsinteraktioner och mekaniska krafter, alla föremål för strikt rumslig och tidsmässig reglering. Därför är det ofta utmanande att fastställa den exakta rollen för en viss signal i en utvecklingsprocess av intresse. Genom att avlägsna embryonala vävnader från sin endogena miljö skapar embryoexplantation en förenklad plattform där man kan urskilja utvecklingsrollerna för enskilda vävnader och molekyler i relativ isolering. Explantationstekniker är kanske mest kända i Xenopus laevis, där de har använts för att studera vävnadsinduktion, cellsignalering, cell vidhäftning och morfogenes, bland andra processer1,2,3,4. Så kallade djurkapslar explanter, där djurregionen av blastula stadium Xenopus embryon isoleras före induktiva interaktioner5,6,7, är en utbredd och kraftfull explantteknik. Unmanipulated djurkapslar är dömda att bli ectoderm7,8. Fortfarande är de kompetenta att svara på flera induktiva faktorer, så att de kan bilda vävnader av alla tre bakterieskikten och genomgå vävnadsanpassade morfogenetiska rörelser9,10,11. Begränsade genetiska verktyg och suboptimell lämplighet för levande avbildning förhindrar dock användningen av Xenopus djurmössa explanter för många utvecklingsbiologer. Genom att explantera blastodermceller från zebrafiskembryon kan forskare kombinera nyttan av djurmössans analys med den optiska klarheten, överflöd av genetiska verktyg och andra experimentella fördelar med zebrafiskmodellsystemet.
Hittills har forskare använt sig av två smaker av zebrafiskexplanter: så kallade pescoider och blastoderm explanter. I pescoidmodellen är hela blastoderm, inklusive marginalzonen, isolerad från äggulan och får utveckla ex vivo utan extraembryonic yolk syncytial layer (YSL)12,13. På detta sätt har pescoider en anmärkningsvärd likhet med Fundulus explanter som genererades för årtionden sedan av Jane Oppenheimer och J.P. Trinkaus14,15. Dessa explanter sammanfattar många aspekter av embryonal mönstra och morfogenes12,13. Men eftersom dessa isolat innehåller endogena signalcentra (den embryonala marginalen) förenklas de inte med avseende på deras molekylära miljö. Alternativt kan forskare generera relativt naiva zebrafisk blastoderm explanter genom att utesluta marginalzonen16,17,18,19,20,21. Unmanipulated zebrafish blastoderm explants uttrycker höga nivåer av benmorfogenetiskt protein (BMP) morfogener19 och ger upphov till icke-neural ektoderm och omslutande lager (EVL) när odlade ex vivo18. De sammanfattar dock många aspekter av axiell mönstraring och morfogenes som svar på exogena signalgradienter19,20,21, liknande Xenopus djurkapslar. Av denna anledning är blastoderm explants en fördelaktig modell för att studera rollen av en given morfogen (eller morfogener) i pelarskiktets specifikation, morfogenetiska cellrörelser och signalgradienter inom en förenklad signalmiljö. Dessutom kan blastodermer från embryon av olika genotyper eller tillstånd kombineras i en enda chimerisk explant19,21 för att undersöka cell/ vävnad autonomi och induktiva interaktioner.
Zebrafish blastoderm explants kan användas för att undersöka embryonala signalers roll (till exempel Nodal) i morfogenes och vävnadsspecifikation under gastrulation. Genom att injicera syntetiskt ndr2 RNA (kodning av en Nodal ligand) i encellsstadiet aktiveras Nodal-signalering i hela embryots blastoderm. Explanter från dessa embryon genererar Nodal-signalgradienter, bildar alla tre bakterielagren och genomgår konvergens- och förlängningsrörelser (C&E) som ses i intakta embryon20. Dessutom används chimeric explants för att illustrera förmågan hos mesoderm vävnader att inducera neuroectoderm från oinsprutade (naiva) blastoderm. Detta protokoll ger instruktioner för att skapa zebrafish blastoderm explants och visar deras nytta i att definiera rollen av Nodal signalering i vävnad induktion och morfogenes.
Denna artikel har beskrivit hur man genererar zebrafish blastoderm explants och diskuterat två praktiska tillämpningar av dessa explants i att ta itu med rollen av Nodal morphogen signalering i gastrulation. Denna metod för skärning och odling av explanter ger en tom skiffer av naiva celler som kan manipuleras med hjälp av RNA-injektioner och behandling med små molekylföreningar för att undersöka en molekylär väg av intresse.
Kritiska steg
Det finns fyra steg i detta protokoll som är särskilt avgörande för dess framgång. Den första är att injicera embryona med lämplig mängd Nodal. Detta protokoll rekommenderar 10 pg ndr2 RNA, och även om en rad doser främjar förlängning, för mycket eller för lite Nodal kommer att förhindra optimal explant förlängning20. Det andra steget är att dechorionera embryona. Om embryona förblir pronase för länge, kommer äggulorna att brista, och embryona kommer inte att vara livskraftiga att skära. Om de inte är i pronase tillräckligt länge, kommer chorionsna inte att lossas genom tvätt och kommer istället att kräva tidskrävande manuell dechorionation. Det tredje kritiska steget är att skära explanterna. Skärning i 3x Danieaus lösning rekommenderas, eftersom den lägre salthalten i 0,3x Danieaus lösning eller äggvatten inte främjar läkning och överlevnad av explanter.
Dessutom måste explanterna skäras på ungefär hälften av blastodermens höjd för att säkerställa cellernas naivitet. Om de skärs för nära äggulan kommer de att innehålla signaler från marginalen (inklusive endogen Nodal) som främjar vävnadsspecifikation och morfogenes. Det fjärde och sista kritiska steget är i läkning av chimeriska explanter. Två explanter smälter inte ihop för att bilda chimeras om inte deras skurna kanter försiktigt pressas ihop omedelbart efter att de har skurits.
Ändringar och felsökning
De kritiska stegen som beskrivs ovan ger möjligheter till felsökning. Några vanliga frågor och föreslagna lösningar presenteras nedan.
Om explanter inte sträcker sig i närvaro av Nodal-signalering finns det några möjliga lösningar. (A) Injicera embryon i encellsstadiet för att säkerställa att RNA är jämnt fördelat över hela embryot. (B) Undvik att injicera för mycket nodala RNA genom att se till att den injicerade volymen är korrekt med hjälp av en mikrometer för att mäta injektionsbolus. (C) Undvik att injicera för lite nodd-RNA genom att mäta dess koncentration för att säkerställa att det inte har försämrats. (D) Håll några åldersmatchade intakta syskon för att härleda motsvarande steg av explanterna. Explanter uppnår maximal förlängning när intakta syskon når 2-5 somite-stadiet. Om explanterna samlas in för tidigt, kommer den optimala förlängningen inte att uppnås.
Om äggulorna spricker efter dechorionation, och embryona inte är livskraftiga att skära, ta bort embryona från pronaselösning när chorions börjar crinkle och 1-2 embryon kasta sin chorion. Skölj sedan omedelbart i äggvatten.
Om explanterna verkar bubblande runt kanterna finns det några lösningar. A) Kapa explanter endast inom en viss tidsram för utvecklingen. Även om explanter som skärs i något skede från 128- till 1000-cellsstadier kan överleva och sträcka sig i kultur, tenderar de som skärs vid 256- till 512-cellsstadier att vara de mest robusta. (B) Se till att explanter skärs i 3x Danieaus lösning för att säkerställa korrekt läkning. C) Skär explanterna rent men försiktigt. Undvik att sträcka eller dra isär cellerna under skärprocessen.
Om de oinsprutade kontrollexplanterna sträcker sig, var det troligt att explanter ska skära för nära äggulan. För att explanter ska vara naiva, se till att snitten görs halvvägs mellan äggulan och toppen av blastoderm.
Om de chimeriska explanterna inte smälter, beror det sannolikt på att tendensen hos explanter i 3x Danieaus lösning när den skärs är att runda upp och läka över skärkanten. För att säkerställa att de två blastodermsna läker till varandra snarare än sig själva, tryck ihop dem omedelbart efter skärning. Använd tång för att applicera mjukt tryck på de nyanslutna blastodermsna i agarosbrunn för att uppmuntra dem att läka tillsammans.
Begränsningar
Medan dessa explanter är ett värdefullt verktyg för att studera rollen av en given morfon (eller en annan molekyl av intresse) i relativ isolering, måste observationer som görs i någon ex vivo-modell tolkas med försiktighet. Explanter uppvisar C&E-morfogenes som är mycket lik den som observerats i vivo20, men de sammanfattar inte alla aspekter av gastrulation, till exempel epibolyrörelser. De saknar också många andra regulatoriska faktorer och signalmolekyler som finns i ett intakt embryo. Även om detta är en betydande experimentell fördel med explanter, kan det också leda till slutsatser som inte håller in vivo. Till exempel, eftersom explanter som inte får exogena Nodal ligands misslyckas med att uttrycka neuroectoderm markörer, man kan dra slutsatsen från explanter ensam att Nodal signalering krävs för neuroectoderm specifikation. Neuroectoderm bildas dock inom intakta embryon som saknar alla Nodal-signalering23,24, vilket visar den vitala rollen för andra signalmolekyler i neuralspecifikation32. Explanter kan berätta för oss vad en morfogener kan i en isolerad miljö. Alla sådana fynd bör dock bekräftas i/jämföras med intakta embryon för att resultaten ska tolkas grundligt. Med andra ord kan explanter inte ersätta ett embryo som utvecklas. Istället är de ett kompletterande verktyg för att identifiera en morfins roll och relation till omgivningen. Med dessa begränsningar i åtanke är zebrafisk blastoderm explanter ett värdefullt verktyg för många forskningsfrågor.
Betydelse för befintliga metoder
Med förnyat intresse för syntetisk embryologi används regelbundet flera ex vivo- och in vitro-metoder för att modellera aspekter av embryonal utveckling. Till exempel kan 2- och 3-dimensionella gastruloider bestående av mus eller mänskliga embryonala / inducerade pluripotenta stamceller koaxeras, genom tillämpning av exogena signalmolekyler, för att rekapitulera några av de mönstrar och/eller morfogenetiska händelserna av gastrulation, segmentering och neurulation33,34,35,36,37 . Även om dessa metoder är kraftfulla kräver de mödosamma och långvariga odlingsmetoder för att både kontinuerligt upprätthålla pluripotenta stamceller och för att odla gastruloider, vilket tar många dagar att nå gastrulationsstadier. Däremot kräver zebrafiskexplanter inget underhåll av stamcellskulturer, eftersom embryon helt enkelt samlas in efter behov. De är relativt enkla att generera och nå gastrulationsstadier inom några timmar, samma som zebrafiskembryon. Detta belyser en annan fördel med zebrafiskexplanter, deras intakta utvecklingsklocka. Eftersom utvecklingsåldern för embryonala och inducerade pluripotenta stamceller kan vara varierande och mycket omdiskuterade, är embryonala explanter kanske bättre lämpade att undersöka tidsmässig reglering av utvecklingen. Slutligen, medan pescoid zebrafish explants (som innehåller den embryonala marginalen) på samma sätt sträcker sig i kultur12,13, gör de det som svar på endogena signalcentra. Istället gör de explanter som beskrivs här det möjligt för forskare att undersöka molekyler av intresse med relativt liten interferens från sådana embryonala signaler.
Potentiella framtida tillämpningar
Här användes explanter för att visa att Nodal signalering är nödvändig och tillräcklig för C&E morfogenes. Ändå förväntas det att de kan och kommer att användas för att urskilja rollen av många olika molekyler i många andra utvecklingsprocesser, till exempel reglering av genuttryck, signalgradienter och ytterligare morfogenetiska program. Dessutom, eftersom dessa explanter är livskraftiga till minst 24 hpf19, kan det förväntas att deras användbarhet kommer att sträcka sig bortom gastrulation till processer som segmentering och organogenes, alla processer där forskare önskar en utvecklingslös tom skiffer.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NICHD R00HD091386 till MLKW och av NIEHS T32ES027801 till AAE.
1 mm glass beads | Millipore-Sigma | Z250473 | |
4% Paraformaldehyde | VWR | J19943-K2 | |
6-well plates | Fisher | FB012927 | |
Agarose | Thermo-Fisher | 16500500 | |
Ca(NO3)2 .4H2O | Thermo-Fisher | 12364-36 | |
DMEM/F12 media | Gibco | 11330032 | |
Dumont #5 watchmakers forceps | World Precision Instruments | 500341 | |
Embryo injection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
Glass crystalizing dishes | Fisher | 08-741A | |
Glass Petri dishes | Fisher | 08-748A | |
HEPES | VWR | JT4018-1 | |
Instant Ocean sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
KCl | VWR | BDH9258-500G | |
Low temperature incubator | Fisher | 15-015-2632 | |
MgSO4.7H2O | VWR | 97062-134 | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
Micrometer | SPI supplies | 02265-AB | |
Mineral oil | VWR | MK635704 | |
NaCl | VWR | BDH9286-500G | |
Newborn Calf Serum | Invitrogen | 26010-066 | |
Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-30 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo-Fisher | 15140122 | |
Pico-pump pneumatic injector | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
Pipet pump | Fisher | 13 683C | |
Plastic Petri dishes 100 mm | Fisher | FB0875712 | |
Plastic Petri dishes 60 mm | Fisher | FB0875713A | |
Plastic wash bottles | Fisher | 03-409-10E | |
Pronase | Millipore-Sigma | 10165921001 | |
Tween-20 | VWR | 200002-836 |