Detta protokoll presenterar en samling sarkom, kalcium och makroskopiska geometriska data från en aktivt entreprenad av hjärt trabecula ex vivo. Dessa samtidiga mätningar möjliggörs genom integrering av tre bildframställningsmetoder.
I hjärtmuskeln aktiverar intracellulära Ca2 + transienter kontraktilament, orsakar sammandragning, makroskopisk förkortning och geometrisk deformation. Vår förståelse av de interna relationerna mellan dessa händelser har begränsats eftersom vi varken kan “se” inuti muskeln eller exakt spåra den spatio-temporala karaktären av excitation-sammandragningsdynamik. För att lösa dessa problem har vi konstruerat en enhet som kombinerar en uppsättning bildframställnings former. Specifikt integrerar det ett brightfield mikroskop för att mäta lokala förändringar av sarkomisk längd och vävnad stam, ett fluorescensmikroskop för att visualisera Ca2 + transient, och en optisk koherens tomografi för att fånga vävnadens geometriska förändringar under hela tidsförloppet för en hjärtcykel. Vi presenterar här bildinfrastrukturen och tillhörande ramverk för datainsamling. Data samlas in från isolerade stångliknande vävnadsstrukturer som kallas trabeculae carneae. I vårt instrument håller ett par positionsstyrda platinakrokar varje ände av ett ex vivo-muskelprov medan det kontinuerligt superfunderas med näringsrik saltlösning. Krokarna är under oberoende kontroll, vilket möjliggör realtidskontroll av muskellängd och kraft. Översättningen på längden möjliggör en bitvis skanning av provet, vilket övervinner begränsningar i samband med mikroskopets bildfönsters relativa storlek (540 μm med 540 μm) och längden på en typisk trabecula (>2000 μm). Platinaelektroder i vardera änden av muskelkammaren stimulerar trabecula med en användardefinierad hastighet. Vi utnyttjar stimuleringssignalen som en utlösare för att synkronisera data från varje bildfönster för att rekonstruera hela provet som rycker under steady-state förhållanden. Att tillämpa bildbehandlingstekniker på dessa ljusfältsavbildningsdata ger vävnadsförskjutning och sarkomlängdskartor. En sådan insamling av data, när den införlivas i en experimentmodelleringspipeline, kommer att ge en djupare förståelse för muskelkontraktil homogenitet och heterogenitet i fysiologi och patofysiologi.
Superfusion av isolerade hjärtmuskelvävnadspreparat är ett standard och allmänt använt protokoll för att studera hjärt jonisk aktivering ochmekanik 1. I synnerhet har isoleringen av trabeculae, stavliknande strukturer från ventrikulära väggar, möjliggjort bedömning av fenomen inklusive längdberoende aktivering av sammandragning2, sträckberoende svar av sammandragning3,4, och diastolisk viskoelasticitet5 av hjärtvävnad. Ter Keurs, initiativtagare till denna teknik för superfusing isolerade trabeculae, använde ursprungligen en kombination av fluorescens imaging för Ca2 + mätningar och laser diffraktion för bestämning sarkomlängder2,5. Sedan dessa tidiga studier har det blivit allt vanligare att extrahera sarkomlängdsinformation med större rumslig upplösning med hjälp av 2D fast Fourier transform (FFT)-baseradetekniker 6 på brightfield mikroskopibilder. De två bildsystemen möjliggör en partiell bedömning av det underliggande förhållandet mellan Ca2 + release och sarkomlängdsberoende kraftproduktion.
Hjärtmuskeln är strimmiga, med den synliga banding som är associerad med en underliggande serie contractila enheter bestående av tjocka och tjocka filament. Interaktionen mellan dessa ingående glödtrådar som utgör sarkomerer ligger till grund för kraftgenerering, som börjar enligt följande: en depolariserande elektrisk signal, eller åtgärdspotential, gör att spänningsberoende L-typ Ca2 + kanaler i cellmembranet öppnas; den efterföljande cellulära tillströmningen av Ca2 + inducerar frisättningen av Ca2 + från sarkoplasmic reticulum (SR), en intracellulär Ca2 + butik, i en process som kallas Ca2 +-inducerad Ca2 + release7; Denna plötsliga ökning av intracellulär Ca2+ koncentration från nanomolar till mikromolar sortiment gör det möjligt att uppnå kraftproduktion; Ca2+ pumpar extruderar kontinuerligt Ca2+ ur cytosolen tillbaka in i SR och extracellulärt fack; när den intracellulära Ca2 + koncentrationen återgår till nanomolarområdet, kraftproduktionen upphör och muskeln slappnar av. Under kraftproduktionen glider de beståndsdelar tjocka och tunna filamenten över varandra. Sarkomlängden dikterar den relativa omfattningen av överlappning och därmed potentialen för kraftproduktion av muskeln makroskopiskt.
I detta dokument utökar vi dessa fluorescens-brightfield imaging tekniker till att omfatta optisk koherens tomografi (OCT). OCT använder den fysiska störningsprincipen och kan samla den geometriska deformationen av vävnad för att förstå muskelkontraktil heterogenitet8. Vår enhet (Figur 1) använder ett Spektrala-domän OCT (SD-OCT) system. I SD-OCT delar en stråldelare upp ljuset från en bredbands kort koherenslängd superluminescerande diod i referens- och mätarmar. Referensarmen innehåller en fast spegel och mätarmen innehåller en 2D-galvanometer för att styra ljuset. Ljus som backas upp från provet samlas in och stör det reflekterade ljuset i referensarmen för att bilda ett interferensmönster. Djupinformationen kodas i frekvensen av spektralfransen. För att extrahera informationen skickas signalen genom en spektrometer och en omvänd FFT tillämpas på resultatet. Motsvarande 1D-signal representerar strukturerna på olika djup, vilket motsvarar förändringar i brytningsindex9 (A-skanning). Genom att styra lasern i en enda axel kan man konstruera ett tvärsnitt av det intresseprov (B-skanning) och på samma sätt genom att upprepa processen i ett stegvist mönster i den återstående axeln kan en tredimensionell bild genereras (C-skanning). I förlängningen kan man samla in en serie B-skanningar på ett enda segment för ett upprepande tidsvarierande ämne baserat på en extern utlösare och upprepa för att generera en tredimensionell skanning, som representerar en tidsvarierande planbild10.
Vid integreringen av de tre bildsystemen har vi övervägt följande två principer. För det första bör bildsensorer inte upptäcka ljus från en alternativ bildframställningsmodalitet, och för det andra bör den fysiska designen innehålla ledigt utrymme för minst tre samtidiga bildplan. För att uppfylla det första kravet använder brightfieldmikroskopet en 660 nm våglängdslampa för att belysa provet i en inverterad konfiguration. Fluorescensmikroskopet är i en epifluorescenskonfiguration där samma objektiv används för både excitation och insamling av det avgivna ljuset. Excitationslampan har en våglängd på mellan 340 nm och 380 nm, och ett fotomultiplierrör (PMT) mäter det avgivna ljuset vid en våglängd på 510 nm. Ett par tärande speglar gör det möjligt för dessa två optiska banor att dela samma fysiska fotavtryck utan att störa den motsatta mätningen (figur 2). Slutligen använder ULT bredbandsljus (100 nm spektralbredd) med en central våglängd på 840 nm, skild från de andra två formerna. På grund av den låga samstämmigheten hos det ljus som används för OCT kommer allt spridda ljus från ljusfältets fluorescenskällor inte att bidra till interferensmönstret som kodar djupinformation. För det andra kravet har höljets konstruktion för kapillärröret tillgängliga optiska vägar till provets främre, sämre och överlägsna plan. Under experiment håller två platinakrokar en trabecula i ett kapillärrör perfused med syresatt Krebs-Henseleit (KH) lösning. Okjovometerns galvanometerhuvud är ortogonalt inriktat på den ljusfältsfluorescensavbildningsväg som kan dra nytta av det tredje ortogonala optiska planet (figur 3).
Detta dokument beskriver designövervägandena för att bygga en enhet som samtidigt kan avbilda kalcium, sarkomlängd och muskelgeometri. För att demonstrera dessa mätfunktioner beskriver vi processen att isolera en ventrikulär trabecula, beredningen av nödvändiga buffertlösningar, tillsammans med de kritiska stegen som är involverade i hantering och fluorescensbelastning av en ex vivo trabecula. Slutligen beskriver det här dokumentet de processer som krävs för att översätta datauppsättningen till mer användbara visualiseringar.
I denna studie presenterar vi en konfiguration som gör det möjligt att montera tre optiska system som kombinerar brightfield, fluorescens och OCT imaging för att samla in data från en aktivt kontrakterande ex vivo hjärt trabecula (figur 1 och figur 2). En sådan orkestrerad integration är möjlig på grund av mätkammarens utformning (figur 3) för att möjliggöra det ortogonala arrangemanget till den ljusfältsfluorescensaxeln. Muskel-montering systemet spelar en lika viktig roll i framgången för samtidiga kvantifieringar av viktiga index i karakterisering hjärt muskel excitation-kontraktion dynamik. Dess nyhet ligger i att möjliggöra muskelskanningsförfaranden utan uppenbar störning av muskelens mekaniska prestanda (figur 6). Med den kombinerade bildkonfigurationen och motoriserade kroksystemet för kraftmätning kan detta system utvärdera regional heterogenitet i Ca2 + transient, förskjutning och sarkomlängd, tillsammans med makroskopisk geometrisk information om en kontrakterande trabecula under hela rycktiden (figurerna 7 och figur 8).
Med tanke på allestädes närvarande av brightfield-epifluorescens bildframställningssystem inom hjärt forskning laboratorier, reproduktionen av dessa resultat kan uppnås med några mindre hårdvara överväganden. Här presenterar vi verktygssatsen för bildbehandling för att kombinera brightfield-epifluorescens och OCT, vilket är viktigt för att analysera den underliggande kontraktil heterogeniteten. Integrationen av ULT kräver en fri optisk bana, medan den gated imaging kräver en extern utlösarlinje mellan stimulansen och både OCT och brightfield imaging camera och muskelmonteringskrokar som kan flytta provet genom hela mätkammaren. Den nödvändiga programvaran och metoderna efter bearbetningen är fritt tillgängliga. I synnerhet är segmenteringsprogramvaran som används, WEKA14, öppen källkod. Tekniken för markörlös spårning av materialpunkter8, sarkomlängd, gated volumetric imaging10, och nätgenereringskoder är också tillgängliga och kan göras tillgängliga på begäran från motsvarande författare.
Muskelkraft, optimal belastning av Fura-2 och bildfokus är de tre pelarna som utgör grunden för ett framgångsrikt experiment. Att använda en dissekeringslösning som innehåller BDM för att förhindra kontraktur, transport av muskeln i en spruta, kontinuerlig syresättning av lösningen och förberedelse av nya experimentella lösningar på dagen för ett experiment bidrar alla till en hög muskel livskraft. Innan trabecula laddas med Fura-2AM, autofluorescens måste samlas in för varje tillstånd man är intresserad av att studera eftersom det kan ha en betydande effekt på den uppmätta Ca2 + transient15. Syresättning av Fura-2AM lastlösning kompliceras av den nödvändiga införandet av tensiden pluronic-F127 för att underlätta färgbelastning. För att bekämpa den resulterande överskottsbubblabildningen orsakad av detta tensid gör en liten droppe skumskydd i lastlösningen det möjligt för användaren att öka syresättningshastigheten och därigenom förbättra risken för att trabecula upprätthåller funktionell livskraft under hela lastningsprocessen. Slutligen måste avbildningsfokus vara enhetligt längs muskellängden för att maximera signal-till-brusförhållandet för brightfield- och fluorescensinformationen.
Det finns två begränsningar att tänka på med de metoder som presenteras här. Den första är den rumsliga upplösningen av fluorescensmikroskopet. Medan de rumsliga upplösningarna för OCT och brightfield imaging är höga, är upplösningen på fluorescensmikroskopet begränsad till integralen av fluorescensen från volymen som fångas inom ett 540 μm med 540 μm bildfönster. Det finns utrymme att öka den rumsliga upplösningen på fluorescensmikroskopet genom att använda en hög förstärkningsladdningsankparerad enhetskamera, istället för en PMT, för att fånga fluorescenssignalen på bekostnad av signal-till-brusförhållandet16. För det andra är diametern på trabecula som kan studeras i termer av mätbar sarkomlängd och geometriskt djup. Metoden med fönster-FFT för databehandlingslängd utnyttjar fördelarna med förbättrad rumslig upplösning men är förknippad med minskad robusthet (figur 8D). I de fall där grumlig eller stor diameter trabeculae ska studeras, kommer FFT: s resolvability att minskas kraftigt på grund av den minskade kontrasten i samband med sarkomisk bandning i större vävnadsprover. På samma sätt kommer backreflektionerna från ett bilddjup på mer än 300 μm inom ULT att vara för svaga för att lösas under segmenteringsstadiet. Därför är vår teknik begränsad till trabeculae med en diameter mindre än 300 μm. Det rekommenderas dock inte att studera prover med stor diameter eftersom det kan finnas problem med diffus syresättning av muskelkärnan under höga stimuleringshastigheter17.
Vår metod möjliggör bedömning av jonisk mekanisk funktion i samband med muskelgeometri i friska och sjuka muskler, vilket ger ett kraftfullt tillvägagångssätt för att förstå hjärtmuskelfysiologi, patofysiologi och farmakologi. Den bildbehandlingspipeline som beskrivs här extraherar data som kommer att vara avgörande för att samla in en djupare förståelse för kontraktil heterogenitet. En väg att fullt ut inse potentialen i en så rik datauppsättning är att bygga matematiska modeller som integrerar och tolkar dessa data och att göra förutsägelser som kan testas experimentellt med hjälp av vår enhet.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie finansierades av doktorandstipendier från University of Auckland (tilldelas JD och MC), Sir Charles Hercus Health Research Fellowships (20/011 och 21/116) från Health Research Council of New Zealand (tilldelas J-CH till KT, respektive), ett doktorandstipendium som delas ut av National Heart Foundation (tilldelas AA), Marsden Fast-Start grants (UOA1504 och UOA1703) från Royal Society of New Zealand (tilldelas J-CH och KT, respektive), och en James Cook Research Fellowship från Royal Society of New Zealand (tilldelas AT). Den ursprungliga utvecklingen av detta instrument finansierades av ett Marsden-anslag (11-UOA-199) från Royal Society of New Zealand (tilldelat AT och PN).
2,3-Butanedione monoxime | Acros Organics | 150375000 | |
20× microscope lens | Nikon | CFI Super Fluor 20× | NA 0.75 |
2D Galvanometer | Thorlabs | GVSM002/M | |
50-50 beam splitter | Thorlabs | FC850-40-50-APC | |
90-10 beam-splitter | Thorlabs | TW850R2A2 | |
Analogue input module | National Instruments | NI-9205 | Records the PMT signal at 200 kHz |
Brightfield imaging light source | CoolLED | PE-2 | 660 nm LAM |
Broadband light source | Superlum | Broadlighter-840 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
Cameralink card | National Instruments | NI-1429 | Brightfield imaging frame grabber |
Carbogen 5 | BOC | Gas code: 181 | |
Condensor lens | Nikon | LWD 0.52 | |
D(+)-Glucose | Merck | 108337 | |
DAQ | National Instruments | NI-6259 | Triggers the galvanometer movement |
Dichroic mirror 1 | Semrock | FF409-Di03 | |
Dichroic mirror 2 | Semrock | FF552-Di02 | |
Diffraction grating | Wasatch Photonics | 1200 lines/mm @840 nm | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
Direct-Q 3 UV System | Merck Millipore | ZRQSVR3WW | Distilled water machine |
Dry bath | Corning | 6875-SB | LSE digital dry bath |
FIJI | ImageJ | Open-source image processing software | |
Fura-2AM pentapotassium salt | Thermofisher | F14186 | |
Hardware FPGA card | National Instruments | NI-7813R | Also controls the triggering of the brightfield capture |
Heparin | Pfizer | 61024 | |
HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
Inverted microscope | Nikon | TI-DH illumination pillar | |
Isofluorane | MedSource | VAPDRUGISO250 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Line-scan camera | Basler | spL2048-70km | Spectrometer camera |
Magnetic stirrer | IKA | 3810000 | RCT basic |
Matlab | Mathworks | Data processing code | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
NaH2PO4.2H2O | Sigma-Aldrich | 71505 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
OCT FPGA card | National Instruments | NI-1483R | |
Oxygen tank | BOC | Gas code: 100D | |
pH meter | Mettler Toledo | MP220 | |
Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422-20 | |
Powerload | Thermofisher | P10020 | |
Superluminescent diode | Broadlighter | D-840 | |
Transimpedance amplifier | Custom | ||
Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
Wistar rat | Vernon Jansen Unit | 8 – 10 weeks | |
Xenon arc lamp | Sutter Instrument | DG-4 | Lambda DG-4 |