미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 이용한 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화
Summary
이 프로토콜은 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 사용하여 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화를 수행하는 방법을 설명합니다. MMC는 미생물을 자동으로 지속적으로 재배 및 하위 재배 할 수 있으며 상대적으로 높은 처리량과 우수한 병렬화로 온라인으로 성장을 모니터링하여 노동 및 시약 소비를 줄일 수 있습니다.
Abstract
기존의 미생물 재배 방법은 일반적으로 번거로운 작업, 낮은 처리량, 낮은 효율 및 노동 및 시약의 큰 소비를 가지고 있습니다. 더욱이, 최근 개발된 마이크로플레이트 기반의 고처리량 재배 방법은 낮은 용존산소, 불량한 혼합물, 심한 증발 및 열 효과로 인해 미생물 성장 상태 및 실험 병렬화가 불량하다. 작은 부피, 높은 처리량 및 강력한 제어 가능성과 같은 마이크로 액적의 많은 장점으로 인해 액적 기반 미세 유체 기술은 이러한 문제를 극복 할 수 있으며, 이는 고처리량 미생물 재배, 스크리닝 및 진화에 대한 많은 종류의 연구에 사용되었습니다. 그러나 대부분의 선행 연구는 실험실 건설 및 적용 단계에 남아 있습니다. 높은 운영 요구 사항, 높은 건설 어려움 및 자동화 된 통합 기술의 부족과 같은 몇 가지 주요 문제는 미생물 연구에서 액적 미세 유체 기술의 광범위한 적용을 제한합니다. 여기에서는 액적 미세유체 기술을 기반으로 자동화된 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)이 성공적으로 개발되어 미생물 액적 재배 과정에서 필요한 접종, 재배, 온라인 모니터링, 하위 재배, 분류 및 샘플링과 같은 기능의 통합을 달성했습니다. 본 프로토콜에서는 야생형 대장 균(E. coli) MG1655 및 메탄올-필수 대장균 균주(MeSV2.2)를 예로 들어 MMC를 사용하여 자동화되고 상대적으로 높은 처리량의 미생물 배양 및 적응 진화를 수행하는 방법을 상세히 소개하였다. 이 방법은 작동하기 쉽고 노동력과 시약을 덜 소비하며 실험 처리량이 높고 데이터 병렬성이 우수하여 기존 재배 방법에 비해 큰 장점이 있습니다. 과학 연구자가 관련 미생물 연구를 수행 할 수있는 저렴한 비용, 작동 친화적이며 결과 신뢰할 수있는 실험 플랫폼을 제공합니다.
Introduction
미생물 재배는 미생물 과학 연구 및 산업 응용을위한 중요한 토대 이며, 미생물 1,2,3의 격리, 식별, 재구성, 스크리닝 및 진화에 널리 사용됩니다. 기존의 미생물 재배 방법은 주로 시험관, 진탕 플라스크 및 고체 플레이트를 재배 용기로 사용하며 진탕 배양기, 분광 광도계, 마이크로 플레이트 판독기 및 미생물 재배, 검출 및 스크리닝을위한 기타 장비와 결합됩니다. 그러나 이러한 방법에는 번거로운 작업, 낮은 처리량, 낮은 효율 및 많은 노동 및 시약 소비와 같은 많은 문제가 있습니다. 최근 몇 년 동안 개발 된 고처리량 재배 방법은 주로 마이크로 플레이트를 기반으로합니다. 그러나 마이크로플레이트는 낮은 수준의 용존 산소, 열악한 혼합 특성, 심한 증발 및 열 효과를 가지며, 이는 종종 불량 한 성장 상태 및 미생물 4,5,6,7의 실험 병렬화로 이어진다; 반면에 자동 재배 및 공정 검출 8,9를 달성하기 위해서는 액체 처리 워크 스테이션 및 마이크로 플레이트 판독기와 같은 값 비싼 장비를 장착해야합니다.
미세 유체 기술의 중요한 분야로서, 액적 미세 유체 학은 전통적인 연속 유동 미세 유체 시스템을 기반으로 최근 몇 년 동안 개발되었습니다. 두 개의 비혼화성 액체상(보통 오일-물)을 사용하여 분산된 마이크로액적을 생성하고 이들(10)에서 작동하는 이산 유동 미세유체 기술이다. 마이크로 액적은 작은 부피, 큰 비표면적, 높은 내부 질량 전달 속도, 구획화로 인한 교차 오염이 없으며 강력한 제어 가능성과 액적의 높은 처리량의 장점을 가지고 있기 때문에 미생물의 고처리량 재배, 선별 및 진화에 액적 미세 유체 기술을 적용하는 많은 종류의 연구가있었습니다11 . 그러나 액적 미세 유체 기술을 대중화하고 널리 적용하기위한 일련의 주요 문제가 여전히 있습니다. 첫째, 액적 미세 유체 공학의 작동은 번거롭고 복잡하여 작업자에게 높은 기술 요구 사항을 초래합니다. 둘째, 액적 미세 유체 기술은 광학, 기계 및 전기 구성 요소를 결합하고 생명 공학 응용 시나리오와 관련되어야합니다. 여러 분야의 협력이 없다면 단일 실험실 또는 팀이 효율적인 액적 미세 유체 제어 시스템을 구축하는 것은 어렵습니다. 셋째, 소량의 마이크로액적(피콜리터(pL)에서 마이크로리터(μL)까지)으로 인해, 서브재배, 분류 및 샘플링과 같은 일부 기본적인 미생물 작업을 위한 액적의 정확한 자동 제어 및 실시간 온라인 검출을 실현하는 데 많은 어려움이 소요되며, 통합 장비 시스템(12)을 구축하는 것도 어렵다.
상기 문제점을 해결하기 위하여, 액적 미세유체 기술(13)에 기초한 자동 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)이 성공적으로 개발되었다. MMC는 액적 인식 모듈, 액적 스펙트럼 감지 모듈, 미세유체 칩 모듈 및 샘플링 모듈의 네 가지 기능 모듈로 구성됩니다. 모든 모듈의 시스템 통합 및 제어를 통해 생성, 재배, 측정 (광학 밀도 (OD) 및 형광), 분리, 융합, 물방울 분류를 포함한 자동화 된 운영 시스템이 정확하게 확립되어 미생물 액적 재배 과정에서 필요한 접종, 재배, 모니터링, 하위 재배, 분류 및 샘플링과 같은 기능의 통합을 달성합니다. MMC는 2-3 μL 부피의 최대 200개의 복제 액적 배양 단위를 보유할 수 있으며, 이는 200개의 진탕 플라스크 배양 단위에 해당한다. 마이크로 액적 재배 시스템은 미생물의 성장 동안 비 오염, 용존 산소, 혼합 및 질량 에너지 교환의 요구 사항을 충족시킬 수 있으며 성장 곡선 측정, 적응 진화, 단일 요인 다단계 분석 및 대사 산물 연구 및 분석 (형광 검출 기준)13,14과 같은 여러 통합 기능을 통해 미생물 연구의 다양한 요구를 충족시킬 수 있습니다.
여기서, 프로토콜은 MMC를 사용하여 자동화 및 미생물 배양 및 적응 진화를 수행하는 방법을 자세히 소개한다(도 1). MMC에서의 적응 진화를 입증하기 위해 야생형 대장 균(E. coli) MG1655를 일례로 하여 성장 곡선 측정 및 메탄올-필수 대장균 균주 MeSV2.215를 수득하였다. MMC 용 운영 소프트웨어가 개발되어 작업을 매우 간단하고 명확하게 만듭니다. 전체 과정에서 사용자는 초기 박테리아 용액을 준비하고 MMC의 조건을 설정 한 다음 박테리아 용액 및 관련 시약을 MMC에 주입해야합니다. 그 후, MMC는 액적 생성, 인식 및 번호 매기기, 재배 및 적응 진화와 같은 작업을 자동으로 수행합니다. 또한 높은 시간 분해능을 가진 물방울의 온라인 검출 (OD 및 형광)을 수행하고 소프트웨어에 관련 데이터 (내보낼 수 있음)를 표시합니다. 작업자는 결과에 따라 언제든지 재배 과정을 중단하고 후속 실험을 위해 표적 액적을 추출 할 수 있습니다. MMC는 작동하기 쉽고 노동력과 시약을 덜 소비하며 상대적으로 높은 실험 처리량과 우수한 데이터 병렬 성을 가지며 이는 기존 재배 방법에 비해 상당한 이점을 가지고 있습니다. 연구자들이 관련 미생물 연구를 수행 할 수있는 저렴한 비용, 작동 친화적이고 강력한 실험 플랫폼을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 사용하여 자동화된 미생물 배양 및 장기 적응 진화를 수행하는 방법을 제시합니다. MMC는 소형화, 자동화 및 고처리량 미생물 배양 시스템입니다. 기존의 미생물 고처리량 배양 방법 및 장비와 비교하여 MMC는 낮은 노동력 및 시약 소비, 간단한 조작, 온라인 검출 (OD 및 형광), 고분해능 데이터 수집 및 우수한 병렬화와 같은 많은 장점을 가지고…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (2018YFA0901500), 중국 국립 자연 과학 재단 (21627812)의 국가 핵심 과학 기기 및 장비 프로젝트 및 칭화 대학 이니셔티브 과학 연구 프로그램 (20161080108)의 지원을 받았다. 또한 메탄올 필수 대장균 균주 버전 2.2(MeSV2.2)의 제공을 위해 Julia A. Vorholt 교수(미생물학 연구소, 생물학과, 취리히 취리히, 취리히 8093, 스위스)에게 감사드립니다.
Materials
| 0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
| 4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
| Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
| EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
| FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
| Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
| High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
| isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
| Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
| Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
| Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
| Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
| Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
| Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
| Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
| Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
| UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
| Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
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