Cultivo microbiano automatizado y evolución adaptativa utilizando el sistema de cultivo de microgotas microbianas (MMC)
Summary
Este protocolo describe cómo utilizar el sistema de cultivo microbiano de microgotas (MMC) para llevar a cabo el cultivo microbiano automatizado y la evolución adaptativa. MMC puede cultivar y subcultivar microorganismos de forma automática y continua y monitorear en línea su crecimiento con un rendimiento relativamente alto y una buena paralelización, reduciendo el consumo de mano de obra y reactivos.
Abstract
Los métodos convencionales de cultivo microbiano generalmente tienen operaciones engorrosas, bajo rendimiento, baja eficiencia y gran consumo de mano de obra y reactivos. Además, los métodos de cultivo de alto rendimiento basados en microplacas desarrollados en los últimos años tienen un estado de crecimiento microbiano deficiente y experimentan paralelización debido a su bajo oxígeno disuelto, mezcla deficiente y evaporación severa y efecto térmico. Debido a muchas ventajas de las microgotas, como el pequeño volumen, el alto rendimiento y la fuerte capacidad de control, la tecnología microfluídica basada en gotas puede superar estos problemas, que se ha utilizado en muchos tipos de investigación de cultivo microbiano de alto rendimiento, cribado y evolución. Sin embargo, la mayoría de los estudios previos permanecen en la etapa de construcción y aplicación del laboratorio. Algunos problemas clave, como los altos requisitos operativos, la alta dificultad de construcción y la falta de tecnología de integración automatizada, restringen la amplia aplicación de la tecnología microfluídica de gotas en la investigación microbiana. Aquí, se desarrolló con éxito un sistema automatizado de cultivo de microgotas microbianas (MMC) basado en tecnología microfluídica de gotas, logrando la integración de funciones como la inoculación, el cultivo, el monitoreo en línea, el subcultivo, la clasificación y el muestreo requeridos por el proceso de cultivo de gotas microbianas. En este protocolo, se tomaron como ejemplos escherichia coli (E. coli) MG1655 de tipo silvestre y una cepa de E. coli esencial de metanol (MeSV2.2) para introducir cómo usar el MMC para llevar a cabo el cultivo microbiano automatizado y de rendimiento relativamente alto y la evolución adaptativa en detalle. Este método es fácil de operar, consume menos mano de obra y reactivos, y tiene un alto rendimiento experimental y una buena paralelización de datos, lo que tiene grandes ventajas en comparación con los métodos de cultivo convencionales. Proporciona una plataforma experimental de bajo costo, fácil de operar y confiable para que los investigadores científicos realicen investigaciones microbianas relacionadas.
Introduction
El cultivo microbiano es una base importante para la investigación científica microbiológica y las aplicaciones industriales, que se utiliza ampliamente en el aislamiento, identificación, reconstrucción, cribado y evolución de microorganismos 1,2,3. Los métodos convencionales de cultivo microbiano utilizan principalmente tubos de ensayo, matraces de agitación y placas sólidas como contenedores de cultivo, combinados con incubadoras de agitación, espectrofotómetros, lectores de microplacas y otros equipos para el cultivo, detección y detección microbiana. Sin embargo, estos métodos tienen muchos problemas, como operaciones engorrosas, bajo rendimiento, baja eficiencia y gran consumo de mano de obra y reactivos. Los métodos de cultivo de alto rendimiento desarrollados en los últimos años se basan principalmente en la microplaca. Pero la microplaca tiene un bajo nivel de oxígeno disuelto, una propiedad de mezcla deficiente y una evaporación severa y un efecto térmico, que a menudo conducen a un mal estado de crecimiento y paralelización experimental de microorganismos 4,5,6,7; por otro lado, necesita estar equipado con equipos costosos, como estaciones de trabajo de manipulación de líquidos y lectores de microplacas, para lograr el cultivo automatizado y la detección de procesos 8,9.
Como una rama importante de la tecnología microfluídica, la microfluídica de gotas se ha desarrollado en los últimos años basada en sistemas microfluídicos tradicionales de flujo continuo. Es una tecnología microfluídica de flujo discreto que utiliza dos fases líquidas inmiscibles (generalmente aceite-agua) para generar microgotas dispersas y operar sobre ellas10. Debido a que las microgotas tienen las características de pequeño volumen, gran área de superficie específica, alta tasa de transferencia de masa interna y sin contaminación cruzada causada por la compartimentación, y las ventajas de una fuerte capacidad de control y alto rendimiento de las gotas, ha habido muchos tipos de investigación que aplican tecnología microfluídica de gotas en el cultivo de alto rendimiento, el cribado y la evolución de microorganismos11 . Sin embargo, todavía hay una serie de cuestiones clave para hacer que la tecnología microfluídica de gotas se popularice y se aplique ampliamente. En primer lugar, el funcionamiento de la microfluídica de gotas es engorroso e intrincado, lo que resulta en altos requisitos técnicos para los operadores. En segundo lugar, la tecnología microfluídica de gotas combina componentes ópticos, mecánicos y eléctricos y debe asociarse con escenarios de aplicación de biotecnología. Es difícil para un solo laboratorio o equipo construir sistemas eficientes de control microfluídico de gotas si no hay una colaboración multidisciplinaria. En tercer lugar, debido al pequeño volumen de microgotas (desde el picolitro (pL) hasta el microlitro (μL)), se necesita mucha dificultad para realizar el control automatizado preciso y la detección en línea en tiempo real de gotas para algunas operaciones microbianas básicas, como el subcultivo, la clasificación y el muestreo, y también es difícil construir un sistema de equipo integrado12.
Para abordar los problemas anteriores, se desarrolló con éxito un sistema automático de cultivo de microgotas microbianas (MMC) basado en la tecnología microfluídica degotas 13. El MMC consta de cuatro módulos funcionales: un módulo de reconocimiento de gotas, un módulo de detección de espectro de gotas, un módulo de chip microfluídico y un módulo de muestreo. A través de la integración y control del sistema de todos los módulos, se establece con precisión el sistema de operación automatizado que incluye la generación, cultivo, medición (densidad óptica (OD) y fluorescencia), división, fusión, clasificación de gotas, logrando la integración de funciones como inoculación, cultivo, monitoreo, subcultivo, clasificación y muestreo requeridos por el proceso de cultivo de gotas microbianas. MMC puede contener hasta 200 unidades de cultivo de gotas replicadas de 2-3 μL de volumen, lo que equivale a 200 unidades de cultivo de matraz de agitación. El sistema de cultivo de microgotas puede satisfacer los requisitos de no contaminación, oxígeno disuelto, mezcla e intercambio masa-energía durante el crecimiento de microorganismos, y satisfacer las diversas necesidades de la investigación microbiana a través de múltiples funciones integradas, por ejemplo, medición de la curva de crecimiento, evolución adaptativa, análisis multinivel de un solo factor e investigación y análisis de metabolitos (basados en la detección de fluorescencia)13,14.
Aquí, el protocolo presenta cómo usar el MMC para llevar a cabo el cultivo automatizado y microbiano y la evolución adaptativa en detalle (Figura 1). Tomamos como ejemplo escherichia coli (E. coli) MG1655 de tipo silvestre para demostrar la medición de la curva de crecimiento y una cepa de E. coli esencial de metanol MeSV2.215 para demostrar la evolución adaptativa en MMC. Se desarrolló un software de operación para MMC, lo que hace que la operación sea muy simple y clara. En todo el proceso, el usuario debe preparar la solución inicial de bacterias, establecer las condiciones del MMC y luego inyectar la solución de bacterias y los reactivos relacionados en el MMC. Posteriormente, el MMC realizará automáticamente operaciones como la generación de gotas, el reconocimiento y la numeración, el cultivo y la evolución adaptativa. También realizará la detección en línea (OD y fluorescencia) de las gotas con alta resolución de tiempo y mostrará los datos relacionados (que se pueden exportar) en el software. El operador puede detener el proceso de cultivo en cualquier momento de acuerdo con los resultados y extraer las gotas objetivo para experimentos posteriores. El MMC es fácil de operar, consume menos mano de obra y reactivos, y tiene un rendimiento experimental relativamente alto y una buena paralelismo de datos, lo que tiene ventajas significativas en comparación con los métodos de cultivo convencionales. Proporciona una plataforma experimental robusta, de bajo costo, fácil de operar para que los investigadores realicen investigaciones microbianas relacionadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo presenta cómo utilizar el sistema de cultivo microbiano de microgotas (MMC) para realizar el cultivo microbiano automatizado y la evolución adaptativa a largo plazo. MMC es un sistema de cultivo microbiano miniaturizado, automatizado y de alto rendimiento. En comparación con los métodos e instrumentos de cultivo microbianos convencionales de alto rendimiento, MMC tiene muchas ventajas, como un bajo consumo de mano de obra y reactivos, operación simple, detección en línea (OD y fluorescencia), recopi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2018YFA0901500), el Proyecto Nacional de Instrumentos y Equipos Científicos Clave de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (21627812) y el Programa de Investigación Científica de la Iniciativa de la Universidad de Tsinghua (20161080108). Julia A. Vorholt (Instituto de Microbiología, Departamento de Biología, ETH Zurich, Zurich 8093, Suiza) por el suministro de la cepa de E. coli esencial para metanol versión 2.2 (MeSV2.2).
Materials
| 0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
| 4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
| Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
| EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
| FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
| Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
| High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
| isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
| Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
| Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
| Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
| Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
| Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
| Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
| Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
| Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
| UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
| Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
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