Визуализация репликативных доменов в ультраструктурно сохраненном хроматине с помощью электронной томографии
Summary
Этот протокол представляет собой метод картирования участков репликации с высоким разрешением в структурно сохраненном хроматине in situ , который использует комбинацию предварительного встраивания маркировки EdU-стрептавидин-Nanogold и ChromEMT.
Abstract
Принципы сворачивания ДНК в ядре клетки и ее динамических превращений, происходящих при выполнении основных генетических функций (транскрипция, репликация, сегрегация и др.), остаются малоизученными, отчасти из-за отсутствия экспериментальных подходов к визуализации высокого разрешения специфических локусов хроматина в структурно сохранившихся ядрах. Здесь представлен протокол визуализации репликативных доменов в монослойной клеточной культуре in situ, путем объединения маркировки EdU вновь синтезированной ДНК с последующим обнаружением меток с Ag-амплификацией частиц Nanogold и окрашиванием ChromEM хроматина. Этот протокол обеспечивает высококонтрастную, высокоэффективную маркировку предварительного встраивания, совместимую с традиционной фиксацией глутаральдегида, которая обеспечивает наилучшую структурную сохранность хроматина для обработки образцов при комнатной температуре. Еще одним преимуществом маркировки предварительного встраивания является возможность предварительного выбора интересующих клеток для секционирования. Это особенно важно для анализа гетерогенных клеточных популяций, а также совместимости с электронно-томографическими подходами к 3D-анализу организации хроматина высокого разрешения в местах репликации и анализу пострепликативной перестройки хроматина и сестринского хроматидного разделения в интерфазе.
Introduction
Репликация ДНК является основным биологическим процессом, необходимым для точного копирования и передачи генетической информации во время деления клеток. У высших эукариот репликация ДНК подвергается жесткой пространственно-временной регуляции, которая проявляется в последовательной активации истоков репликации1. Соседние источники репликации, запускающие синхронно, образуют кластеры репликонов2. На уровне оптической микроскопии участки продолжающейся репликации ДНК обнаруживаются как очаги репликации различного количества и размера. Репликационные очаги демонстрируют специфические закономерности пространственного распределения внутри ядра клетки в зависимости от сроков репликации меченой ДНК 3,4, что, в свою очередь, тесно коррелирует с ее генной активностью. Благодаря четко определенной последовательности репликации ДНК, строго упорядоченной в пространстве и времени, репликативная маркировка является мощным методом точной маркировки ДНК не только для изучения процесса репликации как такового, но и для различения конкретной субфракции ДНК с определенной транскрипционной активностью и уровнем уплотнения. Визуализация реплицирующегося хроматина обычно выполняется путем обнаружения основных белковых компонентов механизма репликации ДНК (либо путем иммуноокрашивания, либо путем экспрессии флуоресцентных белковых меток 5,6) или путем включения модифицированных предшественников синтеза ДНК 7,8,9,10 . Из них только методы, основанные на включении модифицированных нуклеотидов во вновь реплицированную ДНК, позволяют улавливать конформационные изменения хроматина во время репликации и отслеживать поведение репликативных доменов после завершения их репликации.
У высших эукариот упаковка ДНК в хроматин добавляет еще один уровень сложности к регуляции основных генетических функций (транскрипция, репликация, репарация и т. Д.). Складчатость хроматина влияет на доступность ДНК к регуляторным транс-факторам и конформационным изменениям ДНК (размотка двойной спирали), необходимым для синтеза шаблона. Поэтому принято считать, что ДНК-зависимые синтетические процессы в ядре клетки требуют структурного перехода хроматина из его конденсированного, репрессивного состояния в более доступную, открытую конформацию. Цитологически эти два состояния хроматина определяются как гетерохроматин и эухроматин. Тем не менее, до сих пор нет единого мнения относительно способа складывания ДНК в ядре. Гипотезы варьируются от модели11 «полимерного расплава», где нуклеосомное волокно ведет себя как случайный полимер, для которого плотность упаковки контролируется механизмами разделения фаз, до иерархических моделей складывания, постулирующих последовательное формирование хроматиновых волокнистых структур увеличивающейся толщины12,13. Иерархические модели складывания недавно получили поддержку молекулярных подходов, основанных на анализе контактов ДНК-ДНК in situ (захват конформации хромосом, 3C), демонстрируя существование иерархии структурных доменов хроматина14. Важно отметить, что единицы репликации очень хорошо коррелируют с этими хроматиновыми доменами15. Основная критика этих моделей основана на потенциальной искусственной агрегации хроматина, вызванной процедурами пробоподготовки, такими как пермеабилизация клеточных мембран и удаление нехроматиновых компонентов, чтобы улучшить контраст хроматина для ультраструктурных исследований при одновременном улучшении доступности хроматина для различных зондов (например, антител). Последние технические достижения в области селективного окрашивания ДНК для электронной микроскопии путем ДНК-связывающего флуорофоро-опосредованного фотоокисления диаминобензидина (ChromEMT6) позволили устранить это препятствие. Тем не менее, те же соображения справедливы для электронной микроскопии визуализации реплицирующей днк17,18. Здесь мы описываем технику, которая позволяет одновременно проводить ультраструктурное картирование с высоким разрешением вновь синтезированной ДНК и общего хроматина в интактных альдегидно-сшитых клетках. Метод сочетает в себе обнаружение меченой EdU ДНК с помощью Click-химии с биотинилированными зондами и стрептавидином-нанозолотом, а также ChromEMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, описанный здесь, имеет ряд преимуществ перед ранее опубликованными протоколами. Во-первых, использование Click-химии для маркировки реплицированной ДНК устраняет необходимость в предпосылке денатурации ДНК для обнаружения BrdU антителами, тем самым лучше сохраняя ультраструктуру …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана частично РНФ (грант No17-15-01290) и РФФИ (грант No19-015-00273). Авторы благодарят программу развития МГУ им. М.В. Ломоносова (ПНР 5.13) и Центр передового опыта «Никон» по корреляционной визуализации при Белозерском институте физико-химической биологии за доступ к приборам визуализации.
Materials
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
References
- Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
- Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
- Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. Organization of DNA replication. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).
- Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
- Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
- Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
- Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
- Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
- Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
- Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
- Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
- Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
- Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O’Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
- Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
- Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
- Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
- Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
- He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
- Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).
