Summary

소우의 자손에서 이전에 냉동 된 심장 조직에서 미토콘드리아 전자 전송 복합체 측정 : 운동 유발 미토콘드리아 생물 에너지 변화를 평가하는 모델

Published: August 16, 2021
doi:

Summary

이전에 냉동 보관 된 고체 조직에서 미토콘드리아 농축 샘플의 준비는 다양한 실험 양식에서 미토콘드리아의 기능적 및 분석 평가를 모두 수행 할 수 있었습니다. 이 연구는 냉동 심장 조직에서 미토콘드리아농축 제제를 준비하고 미토콘드리아의 분석 평가를 수행하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

미토콘드리아 전자 전달 복합체(ETC) 프로파일은 운동된 뿌리기로 태어난 자손의 심장 조직에서 변형됩니다. 이 가설은 미토콘드리아 ETC 및 초복합 프로파일을 평가하기 위해 가벼운 격리 절차를 사용하여 미토콘드리아를 격리하여 테스트되었습니다. 여기에 설명된 절차는 이전에 동결된 보관된 심장 조직의 처리를 허용하고 미토콘드리아 ETC 복합체, 초복합체 및 ETC 복합 활동 프로파일의 평가를 위한 신선한 미토콘드리아 제제의 필요성을 제거하였다. 이 프로토콜은 다중 항체 기반 면역 블로팅 및 블루 네이티브 젤 전기 포근을 사용하여 슈퍼 복합 평가에서 최적의 ETC 단백질 복합 측정을 설명합니다.

Introduction

이 프로토콜의 목표는 조직 용해및 미토콘드리아의 추출을 향상시키는 조직의 저에너지 기계적 중단의 새로운 기술로 이전에 냉동 된 심장 조직에서 미토콘드리아 농축 된 준비를 얻기위한 상세한 단계를 제공하는 것이었습니다. 이 방법으로, 높은 전단 응력 또는 고온 및 짧은 균질화 시간 (10-12 s)을 생성하지 않고 추출 효율을 향상 달성할 수 있게된다1.

보관된 냉동 조직으로부터 미토콘드리아를 얻으려면 기능2 및 생화학 연구를 모두 수행하는 귀중한 자산입니다3 그렇지 않으면 정확한 실험 조건하에서 쉽게 반복할 수 없다. 고전적인 포터-엘베젬 테플론 유봉 유리 균질화제 또는 두스균제제는 사용되었으며 여전히 간, 신장 및 뇌와 같은 연조직을 균질화하기 위해 연구 실험실에서 사용되고 있습니다. 그러나 근육과 심장과 같은 단단한 조직을 균질화하려면 더 많은 균질화 시간, 효소 치료, 고속 균질화 및 광범위한 사용자 경험이 필요합니다. 이것은 근육과 심장과 같은 단단한 조직에서 미토콘드리아와 같은 온전한 세포기관을 추출하는 데 불리합니다. 본 프로토콜에 기재된 방법은 미토콘드리아-농축 제제를 얻어 미토콘드리아-농축 제제를 얻어 미토콘드리아-단백질 복합체 및 이들의 초복합형성을 운동및 앉아있는 뿌리에서 태어난 자손으로부터 수확하고, 액체 질소에서 플래시 냉동, 향후 사용을 위해 -80°C에 저장된다. 이 방법을 사용하면 사용자가 이전에 냉동 보관된 조직에서 미토콘드리아 농축 제제를 분리할 수 있습니다.

임신 한 설치류에 대한 외부 나노 물질 노출은 임신 4 동안 자손에 심장 기능 과 미토콘드리아 호흡 및 생체 에너지에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 임신 중 태아 근세포 생물 에너지에 에어로빅 운동 유도 긍정적인 변화 아직 문서화 되지 않은. 그러나, 신흥 연구는 임신 중 모계 유산소 운동이 태아 심장 기능에 긍정적 인 영향을 미친다는 증거를 제공합니다5. 추가 증거를 제공하기 위해, 임신 중 자손 심장 미토콘드리아 호흡기 사슬 복합체 (즉, 복합 V를 통한 복합 I)에 대한 모계 운동의 세로 적 효과에 대한 분석이 수행되었습니다.

이 연구는 결과 모성 운동이 자손의 심장 미토콘드리아에 있는 에너지 생산의 효율성을 향상시킨다는 것을 건의할 수 있기 때문에 중요한 건강 관련성이 있습니다. 이 연구에서, 뿌리 (암컷 돼지)는 두 가지 이유로 동물 모델로 사용되었다 : (i) 심장 생리학은 인간6과 유사하고, (ii) 다른 시점에서 자손에서 심장 조직 수확은 기관 IACUC 승인하에 가능하다. 제안된 연구 결과는 모계 운동 및 자손의 심장 조직의 세포 및 생화학적인 메이크업에 그것의 잠재적인 긍정적인 효력을 연결하는 근본적인 질문의 많은 대답을 목표로 합니다. 이 접근법은 임신 도중 태아 심장 근구 내의 생체 에너지 변화의 문제점을 해결한 길고 비용이 많이 드는 종방향 연구 결과에서 얻은 이전에 동결된 심장 조직에서 온화하면서도 효과적인 미토콘드리아 격리 기술을 요구합니다. 이 연구에서 설명된 방법은 분석 및 기능 적 연구를 위한 미토콘드리아 농축 제제를 위해 이전에 냉동 보관된 조직의 큰 금액을 활용할 수 있게 합니다. 연구 결과는 또한 자궁과 그 너머에 있는 심장 건강에 임산부 운동의 효력을 결정하는 미래 연구 결과로 이끌어 낼 수 있던 예비 데이터를 제공함으로써 이 필드에 있는 지식 격차를 채우는 것을 도울 것입니다.

Protocol

냉동 자손 심장 조직은 기관 IACUC 승인 서신과 함께 숀 뉴커머 박사로부터 받았다. 심장 조직은 장기 종방향 연구에서 얻어지고, 액체 질소에서 플래시 동결, 향후 사용을 위해 -80°C에 저장하였다. 자손 심장 조직의 처리에 관한 모든 프로토콜은 캔자스 시티 대학 IBC와 IACUC 위원회의 지침을 따랐다. 1. 버퍼 및 시약 준비 참고: 제조업체의 지침에 따라 모든 ?…

Representative Results

프로토콜에 따라 심장 조직에서 미토콘드리아농축 단백질 혼합물의 좋은 수율을 준비하였다. 미토콘드리아농축 단백질 혼합물의 약 15 mg/mL은 뿌리의 자손으로부터 수확된 평균 1.2g의 냉동 심장 조직으로부터 수득하였다. 미토콘드리아 제제의 양은 (i) 개별 전자 전달 복합체(ETC)를 평가하기 위한 표준 면역블롯 분석을 수행하기에 충분했다(즉, 복합체-I, II, III, IV 및 복합-V), (ii) BN 페이지 및 면역?…

Discussion

이 프로토콜의 중요한 단계는 여기에 표시됩니다. 첫째, 조직 균질화 는 조직 균질화 과정에서 과도한 깎아 지른듯한 효과가 적용되지 않도록 신중하게 처리해야합니다. 초기 조직 균질화에 대한 압력 사이클링 기술 (PCT)의 일부인 조직 분쇄기가 사용되어야합니다. 이 단계는 냉동 조직 조건으로 인해 이미 깨지기 쉬운 미토콘드리아를 더 파괴 할 수있는 유리 온 유리 균질화 (<st…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 캔자스 시티 대학의 교내 보조금으로 압둘바키 아그바스와 다니엘 바레라의 여름 연구 펠로우십에 의해 재정적으로 지원되었습니다. 저자들은 얀 탈리 박사의 편집 작품에 감사한다.

Materials

Amino caproic acid Sigma/Aldrich A2504-100G
Anti-Hu Total OxPhos complex kit Invitrogen 458199
anti-VDAC antibody abcam ab15895 use 1 µg/mL
Coomassie G-250 ThermoSientific 20279
Coomassie GelCode Blue ThermoScientific 24592
Digitonin Cabiochem 300410
Glass-Glass pestle homogenizer VWR KT885451-0020
Image Studio LICOR
IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab LICOR LC0725
Multiwell plate reader BioTek Synergy HT
Native molecular weight marker ThermoFisher BN2001
Nylon mesh monofilament Small Part Inc CMN-74
Orbital shaker ThermoScientfic
PCT Shredder Pressure Bioscience Inc
SEA BLOCK Blocking buffer ThermoScienctific 37527
Shredder PULSE Tube Pressure Bioscience Inc FT500-PS
Table top centrifuge Eppendorf 5418
Trypsin Amresco M150-1G
Trypsin inhibitor Amresco M191-1G Requires fresh preparation

References

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Barrera, D., Upton, S., Rauch, M., Notarianni, T., Eum, K. S., Liberty, M., Sah, S. V., Liu, R., Newcomer, S., May, L. E., Agbas, E., Sage, J., Kosa, E., Agbas, A. Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes. J. Vis. Exp. (174), e62809, doi:10.3791/62809 (2021).

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