Måling av mitokondrieelektronoverføringskomplekser i tidligere frossent hjertevev fra avkom av så: En modell for å vurdere treningsinduserte mitokondriebioenergiendringer
Summary
Utarbeidelse av mitokondri-berikede prøver fra tidligere frosne arkiverte faste vev tillot etterforskerne å utføre både funksjonelle og analytiske vurderinger av mitokondrier i ulike eksperimentelle modaliteter. Denne studien viser hvordan man forbereder mitokondri-berikede preparater fra frossent hjertevev og utfører analytiske vurderinger av mitokondrier.
Abstract
Mitokondrie-elektronoverføringskomplekset (ETC) profilen er modifisert i hjertevevet til avkom født til en utøvd så. Hypotesen som ble foreslått og testet var at en vanlig morsøvelse av en så under graviditet ville øke mitokondrieeffektiviteten til avkom hjertebioenergetikk. Denne hypotesen ble testet ved å isolere mitokondrier ved hjelp av en mild isolasjonsprosedyre for å vurdere mitokondrie ETC og supercomplex profiler. Prosedyren beskrevet her tillot behandling av tidligere frosne arkiverte hjertevev og eliminerte nødvendigheten av fersk mitokondrier forberedelse for vurdering av mitokondrie ETC-komplekser, superkompatibiliteter og ETC komplekse aktivitetsprofiler. Denne protokollen beskriver den optimale ETC-proteinkompleksmålingen i multiplekset antistoffbasert immunoblotting og superkompleks vurdering ved hjelp av blå-innfødt geleelektroforese.
Introduction
Målet med denne protokollen var å gi detaljerte trinn for å oppnå mitokondrier-beriket forberedelse fra tidligere frossent hjertevev med en ny teknologi for mekanisk forstyrrelse av vev med lav energi som forbedrer vevslys og utvinning av mitokondrier. Med denne metoden blir forbedret utvinningseffektivitet uten å generere høy skjærspenning eller høy temperatur og kort homogeniseringstid (10-12 s) oppnåelig1.
For å få mitokondrier fra arkivert frossent vev er en verdifull ressurs for å utføre både funksjonelle2 og biokjemiske studier3 ellers ikke lett repeterbar under de eksakte eksperimentelle forholdene. En klassisk Potter-Elvehjem Teflon pestle glass homogenisator eller Dounce homogenisator har blitt brukt og brukes fortsatt i forskningslaboratorier for å homogenisere bløtvev som lever, nyre og hjerne. Imidlertid krever homogenisering av harde vev som muskel og hjerte mer homogeniseringstid, enzymbehandling, høyhastighets homogenisering og omfattende brukeropplevelse. Dette er ufordelaktig for å trekke ut intakte organeller som mitokondrier fra hardt vev som muskel og hjerte. Metoden beskrevet i denne protokollen brukes til å oppnå høy avkastning mitokondri-beriket forberedelse for å analysere mitokondrie elektron transportkjede (ETC) proteinkomplekser og deres supercomplex dannelse i hjertevev høstet fra avkom født til utøvd og stillesittende så, flash-frossen i flytende nitrogen, og lagret ved -80 °C for fremtidig bruk. Denne metoden gjør det mulig for brukeren å isolere mitokondrier beriket preparat fra tidligere frosne arkiverte vev.
Ekstern nanomaterialeeksponering for gravide gnagere kan påvirke hjertefunksjonen og mitokondrie respirasjon og bioenergi negativt på avkom under svangerskapet4. Likevel er aerob treningsinduserte positive endringer i fosterets myocyttbioenergetikk under graviditet ennå ikke dokumentert. Imidlertid gir nye studier bevis på at mors aerob trening under graviditet har en positiv innflytelse på fosterets hjertefunksjon5. For å gi ytterligere bevis, ble det utført en analyse av langsgående effekter av mors trening på avkom hjerte mitokondrie respiratoriske kjedekomplekser (dvs. kompleks I gjennom kompleks V) under graviditet.
Denne studien har betydelig helserelevans siden resultatene kan tyde på at mors trening forbedrer effektiviteten av energiproduksjon i hjerte mitokondriene til avkom. I denne studien ble søer (kvinnelig gris) brukt som dyremodell av to grunner: (i) hjertefysiologi ligner på human6, og (ii) hjertevevshøst fra avkom fra forskjellige tidspunkter er mulig under en institusjonell IACUC-godkjenning. Den foreslåtte studien tar sikte på å svare på mange av de grunnleggende spørsmålene som knytter mors trening og dens potensielle positive effekter på cellulær og biokjemisk sminke av avkommets hjertevev. Denne tilnærmingen krever milde, men effektive mitokondrier isolasjon teknikker fra tidligere frossent hjertevev hentet fra lange og kostbare langsgående studier som adresserte problemene med bioenergetiske endringer innen foster hjerte myocytter under graviditeten. Metoden beskrevet i denne studien tillater bruk av store summer av tidligere frossent arkivert vev for mitokondrier-beriket forberedelse for både analytiske og funksjonelle studier. Studien vil også bidra til å fylle kunnskapsgapet på dette feltet ved å gi foreløpige data, noe som kan føre til fremtidige studier som bestemmer effekten av mors trening på hjertehelse i utero og utover.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kritiske trinnene for denne protokollen er angitt her. For det første bør vev homogenisering håndteres nøye slik at overdreven rene effekter ikke vil bli brukt under vev homogeniseringsprosessen. En vevsmakuleringsmaskin bør brukes, som er en del av trykksyklingsteknologi (PCT) for innledende vev homogenisering9. Dette trinnet vil redusere den overdrevne slagsyklusen til glass-på-glass homogenisator (figur 1B) som ytterligere kan ødelegge allerede skjøre mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble økonomisk støttet av Kansas City Universitys intramurale stipend for Abdulbaki Agbas og Summer Research Fellowship for Daniel Barrera. Forfatterne er takknemlige for Dr. Jan Talleys redaksjonelle arbeid.
Materials
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
References
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
- Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).
- Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).
- Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
- May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).
- Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
- Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Pressure Biosciences Inc. . Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , (2010).
- McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).
- Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria–a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
- Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
