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Abstract
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생체공학

광학적으로 기화된 퍼플루오로카본 나노방울의 제형 및 음향 변조

Published: July 16, 2021
doi:
10.3791/62814
, ,
1Department of Biomedical Engineering,Georgia Institute of Technology and Emory University, 2School of Electrical Engineering,Georgia Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering and School of Electrical Engineering,Georgia Institute of Technology and Emory University

Summary

광학적으로 활성화 된 퍼플 루오로 카본 나노 방울은 혈관 시스템 외부의 이미징 응용 분야에서 가능성을 보여줍니다. 이 기사에서는 이러한 입자를 합성하고, 폴리아크릴아미드 팬텀을 가교결합하고, 액적을 음향적으로 변조하여 신호를 향상시키는 방법을 보여줍니다.

Abstract

마이크로 버블은 초음파에서 가장 일반적으로 사용되는 영상 조영제입니다. 그러나 크기 때문에 혈관 구획으로 제한됩니다. 이러한 마이크로버블은 혈관을 유출할 수 있을 만큼 충분히 작은 과불화탄소 나노방울(PFCnD)로 응축되거나 공식화될 수 있으며 표적 부위에서 음향적으로 촉발될 수 있습니다. 이들 나노입자는 근적외선 유기 염료 또는 나노입자(예를 들어, 황화구리 나노입자 또는 금 나노입자/나노로드)와 같은 광흡수제를 포함함으로써 더욱 향상될 수 있다. 광학적으로 태그가 지정된 PFCnD는 광학 액적 기화(ODV)로 알려진 공정에서 레이저 조사를 통해 기화될 수 있습니다. 이 활성화 과정은 진단 이미징을 위한 최대 기계적 지수 임계값 미만에서 음향적으로 기화될 수 없는 고비점 퍼플루오로카본 코어의 사용을 가능하게 합니다. 끓는점 코어가 높을수록 기화 후 재응축되는 액적이 생성되어 기화 후 나노액적 형태로 다시 응축되기 전에 잠시 대비를 생성하는 “깜박임” PFCnD가 생성됩니다. 이 프로세스를 반복하여 필요에 따라 대비를 생성할 수 있으므로 광학 및 음향 변조를 통해 배경 없는 이미징, 멀티플렉싱, 초고해상도 및 대비 향상이 가능합니다. 이 기사에서는 프로브 초음파 처리를 사용하여 광학적으로 트리거 가능한 지질 쉘 PFCnD를 합성하고, 나노 방울을 특성화하기 위해 폴리 아크릴아미드 팬텀을 만들고, ODV 후 PFCnD를 음향 조절하여 대비를 개선하는 방법을 보여줍니다.

Introduction

Microbubbles는 연조직에 비해 생체 적합성과 우수한 에코 발생성으로 인해 가장 유비쿼터스 초음파 조영제입니다. 이것은 혈류, 장기 묘사 및기타 응용 프로그램을 시각화하는 데 유용한 도구가 됩니다1. 그러나 공진 주파수를 기반으로 한 이미징에 탁월한 크기 (1-10 μm)는 적용을 혈관 구조2로 제한합니다.

이러한 한계로 인해 액체 퍼플루오로카본 코어 주위에 둘러싸인 계면활성제로 구성된 나노 에멀젼인 PFCnD가 개발되었습니다. 이 나노 입자는 200nm만큼 작은 크기로 합성 될 수 있으며 종양 혈관계에서 발견되는 “누출 된”혈관 구조 또는 기공 및 열린 fenestrations를 활용하도록 설계되었습니다. 이러한 파괴는 종양 의존적이지만,이 투과성은 종양에 따라 ~ 200 nm – 1.2 μm의 나노 입자의 혈관 외 유출을 허용합니다 3,4. 초기 형태에서 이러한 입자는 초음파 대비를 거의 또는 전혀 생성하지 않습니다. 음향 또는 광학적으로 유도 된 기화시 코어 상이 액체에서 기체로 바뀌어 직경 5,6,7이 2 배 반에서5 배 증가하고 광 음향 및 초음파 대비가 생성됩니다. 음향 기화가 가장 일반적인 활성화 방법이지만 이 접근 방식은 기화의 이미징을 제한하는 음향 아티팩트를 생성합니다. 또한 대부분의 퍼플루오로카본은 기화하기 위해 안전 임계값을 초과하는 기계적 지수를 가진 집중 초음파가필요합니다8. 이로 인해 저비점 PFCnD가 개발되었으며, 이는 마이크로 버블을 나노 방울9로 응축하여 합성 할 수 있습니다. 그러나, 이들 액적은 더 휘발성이고 자발적인 기화(10)를 받는다.

반면에 광학 액적 기화 (ODV)는 나노 입자 11,12,13 또는 염료 6,14,15와 같은 광학 트리거를 추가해야하며 ANSI 안전 한계 (11) 내의 플루언스를 사용하여 더 높은 끓는점 퍼플 루오로 카본을 기화 할 수 있습니다. 더 높은 끓는점 코어로 합성된 PFCnD는 더 안정적이고 기화 후 재응축되어 배경 없는 이미징16, 멀티플렉싱(17) 및 초고해상도(18)가 가능합니다. 이러한 기술의 주요 한계 중 하나는 높은 끓는점 PFCnD가 기화 후 밀리 초19의 규모로 짧은 시간 동안 만 에코 생성되고 상대적으로 희미하다는 사실입니다. 이 문제는 반복적인 기화 및 평균화를 통해 완화할 수 있지만 액적 신호의 검출 및 분리는 여전히 과제로 남아 있습니다.

펄스 반전으로부터 영감을 얻어서, 지속 시간 및 대비는 초음파 이미징 펄스(19)의 위상을 수정함으로써 향상될 수 있다. 희박한 단계 (n- 펄스)로 초음파 이미징 펄스를 시작하면 기화 된 PFCnD의 지속 시간과 대비가 모두 증가합니다. 대조적으로, 압축 위상 (p- 펄스)으로 초음파 영상 펄스를 시작하면 대비가 감소하고 지속 시간이 단축됩니다. 이 기사에서는 광학적으로 트리거 가능한 퍼플루오로카본 나노방울, 이미징에 일반적으로 사용되는 폴리아크릴아미드 팬텀을 합성하고 음향 변조를 통해 대비 향상 및 향상된 신호 수명을 입증하는 방법을 설명합니다.

Protocol

1. 퍼플루오로카본 나노방울 제형 10mL 둥근바닥 플라스크를 클로로포름으로 헹구고 10μL 및 1mL 밀폐 유리 주사기를 클로로포름으로 씻어내고 전체 주사기 부피를 반복적으로 흡인하여 총 3회 배출합니다.주의 : 클로로포름은 휘발성이며 흡입하면 유독 할 수 있습니다. 이 용매를 사용한 모든 작업은 흄 후드에서 수행해야합니다. 주사기를 사용하여 200μL의 DSPE-mPEG2000(25mg/mL), 6.3μL?…

Representative Results

PFCnD의 성공적인 포뮬레이션 및 원심 분리는 직경 200-300nm 크기의 액적을 생성해야 합니다(그림 1A). 부적절하게 분리된 액적은 약 1μm의 작은 피크를 보일 수 있습니다. 이러한 용액은 더 큰 물방울을 분해하기 위해 더 많은 욕조를 초음파 처리 할 수 있습니다. 액적의 크기는 Ostwald 숙성21,22로 알려진 과정에서 유착 및/또는 확산으?…

Discussion

프로브 초음파 처리는 PFCnD를 제조하는 비교적 간단하고 배우기 쉬운 방법입니다. 주의를 기울여야 할 몇 가지 단계가 있습니다. 클로로포름을 취급할 때는 휘발성이고 표준 공기 변위 피펫에서 “누출”되므로 용적형 피펫 또는 유리 주사기를 사용해야 합니다. 또한 정변위를 사용하는 경우 클로로포름이 대부분의 플라스틱 팁을 용해시켜 용액에 오염 물질을 유입시킬 수 있으므로 적절한 팁을 사?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 BCRF-20-043 보조금으로 유방암 연구 재단에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

Materials

Ammonium Persulfate (APS) VWR 97064-592
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Polar Lipids 850365C Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG) Avanti Polar Lipids 880120C Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur® VWR EM-1300 acrylamide solution, lower concentration/ powder
IR-1048 Sigma 405175 Infrared dye
L11-4v Verasonics – ultrasound linear array transducer
Microtip 1/8" Qsonica LLC 4418 microtip for probe sonicator
N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED) VWR 97064-902 Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate
Nova II Ophir-Spiricon 7Z01550 laser power meter
Perfluorohexane Fluoromed APF-60M perfluorocarbon liquid
Phosphate buffered saline (PBS) tablets VWR 97062-732 Tablets used to make PBS
Q500 Qsonica LLC Q500-110 Probe sonicator
Silica gel Sigma-Aldrich 288500 2-25 μm particle size
Tempest 30 New wave research – Pulsed laser system
Vantage 128 Verasonics – research ultrasound imaging system
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments Ltd – Makes size measurements based on dynamic light scattering
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References

  1. Schutt, E. G., Klein, D. H., Mattrey, R. M., Riess, J. G. Injectable microbubbles as contrast agents for diagnostic ultrasound imaging: the key role of perfluorochemicals. Angewandte Chemie International Edition. 42 (28), 3218-3235 (2003).
  2. Lee, H., et al. Microbubbles used for contrast enhanced ultrasound and theragnosis: a review of principles to applications. Biomedical Engineering Letters. 7 (2), 59-69 (2017).
  3. Hobbs, S. K., et al. Regulation of transport pathways in tumor vessels: Role of tumor type and microenvironment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (8), 4607-4612 (1998).
  4. Ishida, O., Maruyama, K., Sasaki, K., Iwatsuru, M. Size-dependent extravasation and interstitial localization of polyethyleneglycol liposomes in solid tumor-bearing mice. International Journal of Pharmaceutics. 190 (1), 49-56 (1999).
  5. Wong, Z. Z., Kripfgans, O. D., Qamar, A., Fowlkes, J. B., Bull, J. L. Bubble evolution in acoustic droplet vaporization at physiological temperature via ultra-high speed imaging. Soft Matter. 7 (8), 4009 (2011).
  6. Yu, J., Chen, X., Villanueva, F. S., Kim, K. Vaporization and recondensation dynamics of indocyanine green-loaded perfluoropentane droplets irradiated by a short pulse laser. Applied Physics Letters. 109 (24), 243701 (2016).
  7. Kripfgans, O. D., Fowlkes, J. B., Miller, D. L., Eldevik, O. P., Carson, P. L. Acoustic droplet vaporization for therapeutic and diagnostic applications. Ultrasound in Medicine & Biology. 26 (7), 1177-1189 (2000).
  8. Aliabouzar, M., Kumar, K. N., Sarkar, K. Acoustic vaporization threshold of lipid-coated perfluoropentane droplets. The Journal of the Acoustical Society of America. 143 (4), 2001-2012 (2018).
  9. Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound. Langmuir. 27 (17), 10412-10420 (2011).
  10. Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).
  11. Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Biomedical photoacoustics beyond thermal expansion using triggered nanodroplet vaporization for contrast-enhanced imaging. Nature Communications. 3 (1), 618 (2012).
  12. Strohm, E., Rui, M., Gorelikov, I., Matsuura, N., Kolios, M. Vaporization of perfluorocarbon droplets using optical irradiation. Biomedical Optics Express. 2 (6), 1432 (2011).
  13. Wei, C., et al. Laser-induced cavitation in nanoemulsion with gold nanospheres for blood clot disruption: in vitro results. Optics Letters. 39 (9), 2599 (2014).
  14. Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: Dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2014).
  15. Lajoinie, G., et al. Ultrafast vapourization dynamics of laser-activated polymeric microcapsules. Nature Communications. 5 (1), 3671 (2014).
  16. Hannah, A. S., Luke, G. P., Emelianov, S. Y. Blinking phase-change nanocapsules enable background-free ultrasound imaging. Theranostics. 6 (11), 1866-1876 (2016).
  17. Santiesteban, D. Y., Hallam, K. A., Yarmoska, S. K., Emelianov, S. Y. Color-coded perfluorocarbon nanodroplets for multiplexed ultrasound and photoacoustic imaging. Nano Research. 12 (4), 741-747 (2019).
  18. Luke, G. P., Hannah, A. S., Emelianov, S. Y. Super-resolution ultrasound imaging in vivo with transient laser-activated nanodroplets. Nano Letters. 16 (4), 2556-2559 (2016).
  19. Zhu, Y. I., Yoon, H., Zhao, A. X., Emelianov, S. Y. Leveraging the imaging transmit pulse to manipulate phase-change nanodroplets for contrast-enhanced ultrasound. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (4), 692-700 (2019).
  20. Yoon, H., Zhu, Y. I., Yarmoska, S. K., Emelianov, S. Y. Design and demonstration of a configurable imaging platform for combined laser, ultrasound, and elasticity imaging. IEEE Transactions on Medical Imaging. 38 (7), 1622-1632 (2019).
  21. Taylor, P. Ostwald ripening in emulsions. Advances in Colloid and Interface Science. 75 (2), 107-163 (1998).
  22. Freire, M. G., Dias, A. M. A., Coelho, M. A. Z., Coutinho, J. A. P., Marrucho, I. M. Aging mechanisms of perfluorocarbon emulsions using image analysis. Journal of Colloid and Interface Science. 286 (1), 224-232 (2005).
  23. Yarmoska, S. K., Yoon, H., Emelianov, S. Y. Lipid shell composition plays a critical role in the stable size reduction of perfluorocarbon nanodroplets. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (6), 1489-1499 (2019).
  24. Sheeran, P. S., et al. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).
  25. Lin, S., et al. Optically and acoustically triggerable sub-micron phase-change contrast agents for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. Photoacoustics. 6, 26-36 (2017).
  26. Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).
  27. Shui, L., vanden Berg, A., Eijkel, J. C. T. Scalable attoliter monodisperse droplet formation using multiphase nano-microfluidics. Microfluidics and Nanofluidics. 11 (1), 87-92 (2011).
  28. Jeong, W. -. C., et al. Controlled generation of submicron emulsion droplets via highly stable tip-streaming mode in microfluidic devices. Lab on a Chip. 12 (8), 1446 (2012).
  29. Xu, X., et al. Microfluidic production of nanoscale perfluorocarbon droplets as liquid contrast agents for ultrasound imaging. Lab on a Chip. 17 (20), 3504-3513 (2017).
  30. Song, R., Peng, C., Xu, X., Zou, R., Yao, S. Facile fabrication of uniform nanoscale perfluorocarbon droplets as ultrasound contrast agents. Microfluidics and Nanofluidics. 23 (1), 12 (2019).
  31. Liedtke, S., Wissing, S., Müller, R. H., Mäder, K. Influence of high-pressure homogenisation equipment on nanodispersions characteristics. International Journal of Pharmaceutics. 196 (2), 183-185 (2000).
  32. Reznik, N., Williams, R., Burns, P. N. Investigation of vaporized submicron perfluorocarbon droplets as an ultrasound contrast agent. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1271-1279 (2011).
  33. Grapentin, C., Barnert, S., Schubert, R. Monitoring the stability of perfluorocarbon nanoemulsions by cryo-TEM image analysis and dynamic light scattering. Plos One. 10 (6), 0130674 (2015).
  34. de Gracia Lux, C., et al. Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents. RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).
  35. Zell, K., Sperl, J. I., Vogel, M. W., Niessner, R., Haisch, C. Acoustical properties of selected tissue phantom materials for ultrasound imaging. Physics in Medicine and Biology. 52 (20), 475-484 (2007).
  36. Hariri, A., et al. Polyacrylamide hydrogel phantoms for performance evaluation of multispectral photoacoustic imaging systems. Photoacoustics. 22, 100245 (2021).
  37. Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the range of polyacrylamide gel stiffness for mechanobiology applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
  38. Rajagopal, S., Sadhoo, N., Zeqiri, B. Reference characterisation of sound speed and attenuation of the iec agar-based tissue-mimicking material up to a frequency of 60 MHz. Ultrasound in Medicine & Biology. 41 (1), 317-333 (2015).
  39. Madsen, E. L., Zagzebski, J. A., Banjavie, R. A., Jutila, R. E. Tissue mimicking materials for ultrasound phantoms. Medical Physics. 5 (5), 391-394 (1978).
  40. Kharine, A., et al. Poly(vinyl alcohol) gels for use as tissue phantoms in photoacoustic mammography. Physics in Medicine and Biology. 48 (3), 357-370 (2003).
  41. Kim, H., Chang, J. H. Multimodal photoacoustic imaging as a tool for sentinel lymph node identification and biopsy guidance. Biomedical Engineering Letters. 8 (2), 183-191 (2018).
  42. Zhou, Y., et al. Magnetic nanoparticle-promoted droplet vaporization for in vivo stimuli-responsive cancer theranostics. NPG Asia Materials. 8 (9), 313 (2016).

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Zhao, A., Lee, J., Emelianov, S. Formulation and Acoustic Modulation of Optically Vaporized Perfluorocarbon Nanodroplets. J. Vis. Exp. (173), e62814, doi:10.3791/62814 (2021).
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