נוסחה ואפנון אקוסטי של ננו-טיפות פרפלואורוקרבון שעברו אידוי אופטי
Summary
ננו-טיפות פרפלואורוקרבון המופעלות אופטית מראות הבטחה ביישומי הדמיה מחוץ למערכת כלי הדם. מאמר זה ידגים כיצד לסנתז חלקיקים אלה, להצליב פנטום פוליאקרילאמיד ולווסת את הטיפות באופן אקוסטי כדי לשפר את האות שלהם.
Abstract
Microbubbles הם חומר ניגוד הדמיה הנפוץ ביותר באולטרסאונד. עם זאת, בשל גודלם, הם מוגבלים לתאי כלי הדם. מיקרו-בועות אלה יכולות להיות מרוכזות או מנוסחות כננו-טיפות פרפלואורוקרבון (PFCnDs) שהן קטנות מספיק כדי לחדור ואז להיות מופעלות אקוסטית באתר היעד. ניתן לשפר עוד יותר ננו-חלקיקים אלה על-ידי הכללת בולם אופטי כגון צבע אורגני אינפרה-אדום קרוב או ננו-חלקיקים (לדוגמה, ננו-חלקיקי נחושת גופרתית או ננו-חלקיקי זהב/ננו-רודים). ניתן לאדות PFCnDs המתויגים אופטית באמצעות הקרנת לייזר בתהליך המכונה אידוי טיפות אופטיות (ODV). תהליך הפעלה זה מאפשר שימוש בליבות פרפלואורוקרבון בנקודת רתיחה גבוהה, שלא ניתן לאדות אותן אקוסטית מתחת לסף האינדקס המכני המרבי להדמיית אבחון. ליבות גבוהות יותר של נקודות רתיחה גורמות לטיפות שיתעבו מחדש לאחר אידוי, וכתוצאה מכך “מהבהבות” PFCnDs שמייצרות ניגודיות לזמן קצר לאחר אידוי לפני שהן מתעבות בחזרה לצורת ננו-טיפות. ניתן לחזור על תהליך זה כדי לייצר ניגודיות לפי דרישה, מה שמאפשר הדמיה ללא רקע, ריבוי, רזולוציית-על ושיפור ניגודיות באמצעות אפנון אופטי ואקוסטי כאחד. מאמר זה ידגים כיצד לסנתז PFCnDs של מעטפת ליפידים הניתנים להפעלה אופטית תוך שימוש בסוניקציה של בדיקה, ליצור פנטומים פוליאקרילאמיד כדי לאפיין את הננו-טיפות, ולווסת אקוסטית את ה-PFCnDs לאחר ODV כדי לשפר את הניגודיות.
Introduction
מיקרו-שבבים הם חומר הניגוד האולטרסאונד הנפוץ ביותר בשל תאימותם הביולוגית והאקוגניות המצוינת שלהם בהשוואה לרקמות רכות. זה הופך אותם לכלים חשובים להדמיית זרימת הדם, תיחום איברים ויישומים אחרים1. עם זאת, גודלם (1-10 מיקרומטר), מה שהופך אותם יוצאי דופן להדמיה בהתבסס על תדירות התהודה שלהם, מגביל את היישומים שלהם לכלי הדם2.
מגבלה זו הובילה לפיתוח PFCnDs, שהם ננו-אמולסיות המורכבות מחומר פעילי שטח העטופים סביב ליבת פרפלואורוקרבון נוזלית. ננו-חלקיקים אלה יכולים להיות מסונתזים בגדלים של עד 200 ננומטר והם מתוכננים לנצל את כלי הדם או הנקבוביות “דולפים” ואת הפנסטרציות הפתוחות הנמצאות בכלי הדם של הגידול. בעוד ששיבושים אלה תלויים בגידול, חדירות זו מאפשרת אקסטרווזיה של ננו-חלקיקים מ~200 ננומטר – 1.2 מיקרומטר בהתאם לגידול 3,4. בצורתם הראשונית, חלקיקים אלה מייצרים ניגודיות אולטרסאונד מועטה עד אפסית. עם אידוי – המושרה אקוסטית או אופטית – פאזת הליבה משתנה מנוזל לגז, מה שגורם לעלייה של פי שניים וחצי עד פי חמישה בקוטר 5,6,7 ויוצר ניגודיות פוטואקוסטית ואולטרסאונד. בעוד אידוי אקוסטי הוא שיטת ההפעלה הנפוצה ביותר, גישה זו יוצרת ממצאים אקוסטיים המגבילים את הדמיית האידוי. בנוסף, רוב הפרפלואורוקרבונים דורשים אולטרסאונד ממוקד עם אינדקס מכני מעבר לסף הבטיחות כדי לאדות8. זה הוביל לפיתוח של PFCnDs נקודת רתיחה נמוכה יותר, אשר ניתן לסנתז על ידי עיבוי microbubbles לתוך ננוטיפות9. עם זאת, טיפות אלה הן תנודתיות יותר וכפופות לאידוי ספונטני10.
אידוי טיפות אופטי (ODV), לעומת זאת, דורש תוספת של הדק אופטי כגון ננו-חלקיקים 11,12,13 או צבע 6,14,15 ויכול לאדות פרפלואורוקרבונים גבוהים יותר של נקודת רתיחה באמצעות פלואנציות בתוך מגבלת הבטיחות של ANSI 11. PFCnDs מסונתזים עם ליבות נקודת רתיחה גבוהות יותר הם יציבים יותר ויתעבו מחדש לאחר אידוי, מה שמאפשר הדמיה ללא רקע16, ריבוב 17 וסופר-רזולוציה18. אחת המגבלות העיקריות של טכניקות אלה היא העובדה כי PFCnDs נקודת רתיחה גבוהה הם אקוגניים לאחר אידוי למשך פרק זמן קצר בלבד, בקנה מידה שלאלפיות השנייה 19, והם קלושים יחסית. בעוד שניתן למתן בעיה זו באמצעות אידויים חוזרים ונשנים וממוצע, זיהוי והפרדה של אות טיפה נותר אתגר.
בהשראת היפוך הדופק, ניתן לשפר את משך הזמן והניגודיות על ידי שינוי השלב של דופק הדמיית האולטרסאונד19. על ידי הפעלת פולס הדמיית האולטרסאונד עם פאזה נדירה (n-pulse), הן משך הזמן והן הניגודיות של PFCnDs התאדה גדלים. לעומת זאת, הפעלת פולס הדמיית האולטרסאונד בשלב דחיסה (p-pulse), מביאה לניגודיות מופחתת ולקיצור משך הזמן. מאמר זה יתאר כיצד לסנתז ננו-טיפות פרפלואורוקרבון הניתנות להפעלה אופטית, פנטום פוליאקרילאמיד הנפוץ בהדמיה, ולהדגים שיפור ניגודיות ואורך חיים משופר של האות באמצעות אפנון אקוסטי.
Protocol
Representative Results
Discussion
סוניקציה של בדיקה היא שיטה פשוטה יחסית וקלה ללמידה לייצור PFCnDs. ישנם כמה צעדים שבהם יש לנקוט בזהירות. כאשר מטפלים בכלורופורם, זה הכרחי כי פיפטה עקירה חיובית או מזרקי זכוכית משמש, כפי שהוא נדיף יהיה “לדלוף” מן פיפטות תזוזה אוויר סטנדרטי. יתר על כן, אם משתמשים בתזוזה חיובית, ודא כי קצה מתאים משמ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכה בחלקה על ידי הקרן לחקר סרטן השד תחת מענק BCRF-20-043.
Materials
| Ammonium Persulfate (APS) | VWR | 97064-592 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical. |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880120C | Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical. |
| Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur® | VWR | EM-1300 | acrylamide solution, lower concentration/ powder |
| IR-1048 | Sigma | 405175 | Infrared dye |
| L11-4v | Verasonics | – | ultrasound linear array transducer |
| Microtip 1/8" | Qsonica LLC | 4418 | microtip for probe sonicator |
| N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED) | VWR | 97064-902 | Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate |
| Nova II | Ophir-Spiricon | 7Z01550 | laser power meter |
| Perfluorohexane | Fluoromed | APF-60M | perfluorocarbon liquid |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablets | VWR | 97062-732 | Tablets used to make PBS |
| Q500 | Qsonica LLC | Q500-110 | Probe sonicator |
| Silica gel | Sigma-Aldrich | 288500 | 2-25 μm particle size |
| Tempest 30 | New wave research | – | Pulsed laser system |
| Vantage 128 | Verasonics | – | research ultrasound imaging system |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Instruments Ltd | – | Makes size measurements based on dynamic light scattering |
References
- Schutt, E. G., Klein, D. H., Mattrey, R. M., Riess, J. G. Injectable microbubbles as contrast agents for diagnostic ultrasound imaging: the key role of perfluorochemicals. Angewandte Chemie International Edition. 42 (28), 3218-3235 (2003).
- Lee, H., et al. Microbubbles used for contrast enhanced ultrasound and theragnosis: a review of principles to applications. Biomedical Engineering Letters. 7 (2), 59-69 (2017).
- Hobbs, S. K., et al. Regulation of transport pathways in tumor vessels: Role of tumor type and microenvironment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (8), 4607-4612 (1998).
- Ishida, O., Maruyama, K., Sasaki, K., Iwatsuru, M. Size-dependent extravasation and interstitial localization of polyethyleneglycol liposomes in solid tumor-bearing mice. International Journal of Pharmaceutics. 190 (1), 49-56 (1999).
- Wong, Z. Z., Kripfgans, O. D., Qamar, A., Fowlkes, J. B., Bull, J. L. Bubble evolution in acoustic droplet vaporization at physiological temperature via ultra-high speed imaging. Soft Matter. 7 (8), 4009 (2011).
- Yu, J., Chen, X., Villanueva, F. S., Kim, K. Vaporization and recondensation dynamics of indocyanine green-loaded perfluoropentane droplets irradiated by a short pulse laser. Applied Physics Letters. 109 (24), 243701 (2016).
- Kripfgans, O. D., Fowlkes, J. B., Miller, D. L., Eldevik, O. P., Carson, P. L. Acoustic droplet vaporization for therapeutic and diagnostic applications. Ultrasound in Medicine & Biology. 26 (7), 1177-1189 (2000).
- Aliabouzar, M., Kumar, K. N., Sarkar, K. Acoustic vaporization threshold of lipid-coated perfluoropentane droplets. The Journal of the Acoustical Society of America. 143 (4), 2001-2012 (2018).
- Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound. Langmuir. 27 (17), 10412-10420 (2011).
- Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).
- Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Biomedical photoacoustics beyond thermal expansion using triggered nanodroplet vaporization for contrast-enhanced imaging. Nature Communications. 3 (1), 618 (2012).
- Strohm, E., Rui, M., Gorelikov, I., Matsuura, N., Kolios, M. Vaporization of perfluorocarbon droplets using optical irradiation. Biomedical Optics Express. 2 (6), 1432 (2011).
- Wei, C., et al. Laser-induced cavitation in nanoemulsion with gold nanospheres for blood clot disruption: in vitro results. Optics Letters. 39 (9), 2599 (2014).
- Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: Dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2014).
- Lajoinie, G., et al. Ultrafast vapourization dynamics of laser-activated polymeric microcapsules. Nature Communications. 5 (1), 3671 (2014).
- Hannah, A. S., Luke, G. P., Emelianov, S. Y. Blinking phase-change nanocapsules enable background-free ultrasound imaging. Theranostics. 6 (11), 1866-1876 (2016).
- Santiesteban, D. Y., Hallam, K. A., Yarmoska, S. K., Emelianov, S. Y. Color-coded perfluorocarbon nanodroplets for multiplexed ultrasound and photoacoustic imaging. Nano Research. 12 (4), 741-747 (2019).
- Luke, G. P., Hannah, A. S., Emelianov, S. Y. Super-resolution ultrasound imaging in vivo with transient laser-activated nanodroplets. Nano Letters. 16 (4), 2556-2559 (2016).
- Zhu, Y. I., Yoon, H., Zhao, A. X., Emelianov, S. Y. Leveraging the imaging transmit pulse to manipulate phase-change nanodroplets for contrast-enhanced ultrasound. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (4), 692-700 (2019).
- Yoon, H., Zhu, Y. I., Yarmoska, S. K., Emelianov, S. Y. Design and demonstration of a configurable imaging platform for combined laser, ultrasound, and elasticity imaging. IEEE Transactions on Medical Imaging. 38 (7), 1622-1632 (2019).
- Taylor, P. Ostwald ripening in emulsions. Advances in Colloid and Interface Science. 75 (2), 107-163 (1998).
- Freire, M. G., Dias, A. M. A., Coelho, M. A. Z., Coutinho, J. A. P., Marrucho, I. M. Aging mechanisms of perfluorocarbon emulsions using image analysis. Journal of Colloid and Interface Science. 286 (1), 224-232 (2005).
- Yarmoska, S. K., Yoon, H., Emelianov, S. Y. Lipid shell composition plays a critical role in the stable size reduction of perfluorocarbon nanodroplets. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (6), 1489-1499 (2019).
- Sheeran, P. S., et al. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).
- Lin, S., et al. Optically and acoustically triggerable sub-micron phase-change contrast agents for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. Photoacoustics. 6, 26-36 (2017).
- Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).
- Shui, L., vanden Berg, A., Eijkel, J. C. T. Scalable attoliter monodisperse droplet formation using multiphase nano-microfluidics. Microfluidics and Nanofluidics. 11 (1), 87-92 (2011).
- Jeong, W. -. C., et al. Controlled generation of submicron emulsion droplets via highly stable tip-streaming mode in microfluidic devices. Lab on a Chip. 12 (8), 1446 (2012).
- Xu, X., et al. Microfluidic production of nanoscale perfluorocarbon droplets as liquid contrast agents for ultrasound imaging. Lab on a Chip. 17 (20), 3504-3513 (2017).
- Song, R., Peng, C., Xu, X., Zou, R., Yao, S. Facile fabrication of uniform nanoscale perfluorocarbon droplets as ultrasound contrast agents. Microfluidics and Nanofluidics. 23 (1), 12 (2019).
- Liedtke, S., Wissing, S., Müller, R. H., Mäder, K. Influence of high-pressure homogenisation equipment on nanodispersions characteristics. International Journal of Pharmaceutics. 196 (2), 183-185 (2000).
- Reznik, N., Williams, R., Burns, P. N. Investigation of vaporized submicron perfluorocarbon droplets as an ultrasound contrast agent. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1271-1279 (2011).
- Grapentin, C., Barnert, S., Schubert, R. Monitoring the stability of perfluorocarbon nanoemulsions by cryo-TEM image analysis and dynamic light scattering. Plos One. 10 (6), 0130674 (2015).
- de Gracia Lux, C., et al. Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents. RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).
- Zell, K., Sperl, J. I., Vogel, M. W., Niessner, R., Haisch, C. Acoustical properties of selected tissue phantom materials for ultrasound imaging. Physics in Medicine and Biology. 52 (20), 475-484 (2007).
- Hariri, A., et al. Polyacrylamide hydrogel phantoms for performance evaluation of multispectral photoacoustic imaging systems. Photoacoustics. 22, 100245 (2021).
- Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the range of polyacrylamide gel stiffness for mechanobiology applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
- Rajagopal, S., Sadhoo, N., Zeqiri, B. Reference characterisation of sound speed and attenuation of the iec agar-based tissue-mimicking material up to a frequency of 60 MHz. Ultrasound in Medicine & Biology. 41 (1), 317-333 (2015).
- Madsen, E. L., Zagzebski, J. A., Banjavie, R. A., Jutila, R. E. Tissue mimicking materials for ultrasound phantoms. Medical Physics. 5 (5), 391-394 (1978).
- Kharine, A., et al. Poly(vinyl alcohol) gels for use as tissue phantoms in photoacoustic mammography. Physics in Medicine and Biology. 48 (3), 357-370 (2003).
- Kim, H., Chang, J. H. Multimodal photoacoustic imaging as a tool for sentinel lymph node identification and biopsy guidance. Biomedical Engineering Letters. 8 (2), 183-191 (2018).
- Zhou, Y., et al. Magnetic nanoparticle-promoted droplet vaporization for in vivo stimuli-responsive cancer theranostics. NPG Asia Materials. 8 (9), 313 (2016).
