잘 특성화 된 유전 부분은 새로운 유전 회로의 설계에 필요합니다. 여기에서는 유전 부분을 신속하게 특성화하기 위한 비용 효율적이고 처리량이 높은 방법을 설명합니다. 당사의 방법은 무세포 용해물, 복제를 방지하기 위한 선형 DNA, 처리량을 늘리고 반응량을 줄이기 위한 음향 액체 처리를 결합하여 비용과 시간을 줄입니다.
유전 부분을 특성화하고 분류하는 것은 유용한 유전 회로의 설계에 매우 중요합니다. 잘 특성화 된 부품을 사용하면 유전 회로를 미세 조정할 수 있으므로 기능이 예측 가능한 결과를 얻을 수 있습니다. 합성 생물학이 한 분야로 성장함에 따라 감지, 대사 변경 및 세포 컴퓨팅과 관련된 기능을 실행하기 위해 미생물에 구현 된 유전 회로가 폭발적으로 증가했습니다. 여기에서는 유전 적 부분을 특성화하는 신속하고 비용 효율적인 방법을 보여줍니다. 당사의 방법은 리포터 단백질의 발현을 통해 부분을 평가하기 위한 배지로 자체 준비된 무세포 용해물을 활용합니다. 주형 DNA는 리포터 유전자에 변이체 부분을 추가하기 위해 저렴한 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 제조되며, 주형은 클로닝없이 선형 DNA로서 반응에 추가됩니다. 이러한 방식으로 첨가될 수 있는 부품은 프로모터, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위, 절연체 및 터미네이터를 포함한다. 이 접근 방식은 음향 액체 처리기 및 384웰 플레이트의 통합과 결합되어 사용자가 하루 만에 유전 부품의 고처리량 평가를 수행할 수 있도록 합니다. 이에 비해 세포 기반 스크리닝 접근법은 시간이 많이 소요되는 클로닝이 필요하며 야간 배양 및 배양 밀도 정규화 단계로 인해 검사 시간이 더 깁니다. 또한 무세포 용해물에서 작업하면 사용자가 정확한 농도로 외인성 성분과 DNA를 추가하여 발현 조건을 보다 엄격하게 제어할 수 있습니다. 무세포 스크리닝에서 얻은 결과는 무세포 시스템의 응용 분야에 직접 사용하거나 경우에 따라 전체 세포의 기능을 예측하는 방법으로 사용할 수 있습니다.
합성 생물학의 핵심 노력은 미생물 또는 무세포 용해물에 배치될 때 유용한 기능을 수행하는 유전 회로1를 구성하는 데 사용할 수 있는 잘 특성화된 부품을 포함하는 유전 도구 키트를 개발하는 것입니다. 이러한 유전 회로가 견인력을 얻은 영역은 감지 2,3,4, 인간의 성능 5,6, 바이오 연료 7,8, 재료 생산 9,10 및 셀룰러 컴퓨팅 11입니다. 표준화된 유전 부분의 레지스트리가 설립되었다12 새로운 부분과 기존 부분을 프로모터, 오퍼레이터, 코딩 서열 및 터미네이터와 같은 범주로 분류하기 위해, 단지 몇 가지만 예를 들자면. iGEM(International Gennetically Engineered Machines) 대회13와 같은 노력은 이러한 유전적 부분을 특성화하고 분류하는 데 중요한 역할을 했습니다. 이들 부분들을 유용한 유전 회로(14, 15)로 신속하게 조립하는 것을 용이하게 하기 위해 많은 방법들이 개발되었다. 소프트웨어는 심지어 원하는 기능을 달성하는 회로로 잘 특성화 된 부품의 구성을 자동화하기 위해 개발되었습니다16. 그러나 예측 가능한 기능을 가진 유용한 유전 회로의 조립은 유전 도구 키트에 잘 특성화 된 유전 부분이 포함되어 있다는 가정에 근거합니다. 합성 생물학의 발전을 향한 이러한 도구 키트의 필요성으로 인해 적절한 특성화 데이터를 가진 회로 및 부품을 더 잘 분류하기 위한 수많은 노력이 설명되었습니다 17,18,19,20,21.
유전적 성분을 특성화하는 한 가지 접근법은 생체외 전사 및 번역과 같은 세포 기능을 재구성하는 무세포 단백질 합성(CFPS) 시스템을 사용하는 것이다 22. 여러 연구에서 유전자 구성 요소 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 를 프로토타이핑하기 위한 CFPS의 잠재력을 입증했습니다. 무세포 시스템에 직접 적용하거나 라이브러리 내 부분의 상대적 활성과 같은 세포에서 유전 구조의 기능을 예측 하기 위한 29 , 대사 경로 최적화27, 및 세포 부담30. 이러한 연구에서 강조된 세포 대비 CFPS에서 프로토타이핑의 이점에는 시간 소모적인 클로닝 방지, DNA 및 기타 반응 성분의 농도에 대한 정밀한 제어, 여러 DNA 구조를 쉽게 혼합 및 일치시킬 수 있는 기능이 포함됩니다. 클로닝 방지의 이점은 선형 DNA 주형을 사용할 때 특히 분명하며, 이를 통해33일이 아닌 몇 시간이 걸리는 시험관내 방법으로 새로운 구축물을 조립할 수 있습니다. 단순히 피펫팅에 의해 DNA 구축물 및 기타 성분의 농도를 조작할 수 있는 능력은 액체 취급 로봇(34,35)에 의해 구동되는 고처리량 실험을 가능하게 함으로써 접근법을 더욱 매력적으로 만든다. 프로토타이핑에 CFPS를 사용한 성공이 보고되었지만 CFPS 결과가 세포의 기능을 안정적으로 예측할 수 있는 컨텍스트에서 두고 봐야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
여기에서는 기존 셀 기반 접근 방식에 비해 속도, 처리량 및 비용의 이점을 강조하는 CFPS 프로토타이핑 방법을 제시합니다. 이 접근법은 CFPS를 사용하여 전사 인자 TetR32에 의해 조절되는 T7 프로모터 변이체 라이브러리를 신속하게 특성화하여 당시문헌 36,37에서 사용 가능한 소수의 조절된 T7 프로모터 변이체를 크게 확장한 이전 연구에서 파생되었습니다. 다른 사람들은 그 이후로 그러한 발기인(38)의 범위를 더욱 확장시켰다. 우리의 방법에서, 유전자 구성 어셈블리는 PCR을 사용하여 리포터 유전자에 변이 유전 부분을 추가하는 프라이머를 통해 주형 DNA를 증폭함으로써 가속화됩니다. 384웰 플레이트의 음향 액체 처리는 처리량을 늘리고 필요한 재료의 양을 줄이는 데 사용됩니다. 이전 연구는 더 큰 부피41의 수동 피펫팅에 필적하는 가변성으로 상당히 낮은 부피39,40에서 음향 액체 처리의 성공적인 사용을 입증했습니다. 이 방법 외에도 문제 해결 정보와 잠재적 비용 및 시간 절약에 대한 평가를 제공합니다. Sun et al.42를 기반으로 한 무세포 용해물을 생산하기 위한 프로토콜이 여기에 포함되어 있지만 수많은 다른 상용 키트 및 프로토콜(43,44)도 작동해야 합니다. 유사하게, 프로모터 변이체32의 특성화를 위한 방법을 입증하는 동안, 다른 부분은 PCR 증폭에 의해 교환될 수 있으며, 예를 들어 리보레귤레이터, 리보솜 결합 부위 (RBS), 절연체, 단백질 태그, 및 터미네이터. 우리는 이 방법론이 합성 생물학 커뮤니티가 유용한 기능을 가진 예측 가능한 유전 회로의 조립을 위한 특성화된 부품의 수를 계속 늘리는 데 도움이 되기를 바랍니다.
여기에 설명된 프로토콜은 CFPS에 의한 리포터 단백질의 발현을 통해 유전자 부분을 스크리닝하는 비용 효율적이고 신속한 수단을 제공합니다. 잘 특성화 된 유전 부분은 유용한 기능을 가진 예측 가능한 유전 회로의 설계에 중요합니다. 이 방법론은 세포 용해물에서 단백질 발현의 대사 과정을 유지하여 세포 환경을 반영하는 기능을 유지하면서 살아있는 세포에서 작동해야 하는 요구 사항을 제거하여 처리량을 늘리고 새로운 유전 부분을 스크리닝하는 데 필요한 시간을 줄입니다. 당사의 프로토콜은 프라이머 수령 후 1일 이내에 수행할 수 있습니다(반응 준비의 경우 ~2.5-6시간, CFPS 반응의 경우 2-16시간; 도 1), 전통적인 클로닝의 경우 최소 3일(구축물 조립 및 형질전환, 클론의 서열 검증, 및 평가를 위한 세포의 배양을 위해 각각 1일)과 비교하였다. 또한 선형 DNA를 사용하는 구조물당 비용은 기존 클로닝의 약 1/3이라고 추정합니다($78 대 $237; 보충표 1) 방법. 상업용 합성 서비스는 현재 규모에 따라 영업일 기준 최소 4일을 인용하지만 선형 조각을 CFPS에서 직접 스크리닝하는 경우 당사 방법과 유사한 비용이 듭니다($78 대 $91). 이 접근 방식을 확인하지 않았습니다. CFPS로 부품을 평가하는 데 드는 비용은 템플릿 DNA 생성에 비해 적지만($0.05/반응22 대 템플릿당 $78), 벌크 시약 및 용해 장비의 시작 비용은 최소 수천 달러입니다. 음향 액체 처리기를 사용하면 0.5 μL40까지 더 작은 부피를 가능하게하여 비용이 약간만 향상됩니다. 더 중요한 이점은 반응 준비 시간이 단축된다는 것입니다 (반응 수에 따라 ~ 10 분 대 최대 1 시간), 특히 많은 수의 반응을 준비 할 때 배양 전에 준비된 반응에 대한 우려가 제기됩니다.
빠르고 비용 효율적이지만 CFPS 프로토타이핑이 생체 내 기능을 적절하게 예측하는 시기에 대한 한계는 여전히 남아 있습니다. 예를 들어, 게놈 DNA와의 교차 반응은 CFPS 시스템의 생산 동안 숙주 게놈의 제거로 인해 검출되지 않을 것이다. 또한, 성분 농도는 세포(51)에서보다 CFPS에서 1-2배 더 낮을 수 있으며, 이는 상이한 거대분자 밀집 조건의 결과로서 일부 부품의 거동에 영향을 미칠 가능성이 있다. 또한, 생체 내 기능을 예측하는 선형 DNA의 능력은 예를 들어 DNA 2차 구조가 중요한 역할을 하는 경우 제한될 수 있다. 마지막 제한 사항은 함수를 테스트하기 전에 구문이 시퀀스 확인되지 않는다는 것입니다. 특성화 된 부분이 실제로 의도 된 이론적 순서와 정렬되지 않는 경우가있을 수 있습니다. 이러한 모든 제한은 의도된 생체내 적용에서 이 방법에 의해 스크리닝된 부품의 서브세트를 검증함으로써 완화될 수 있다.
우리는 원래 하이브리드 T7-tetO 프로모터32에 대한 작업자 위치 변경의 효과를 조사하기 위해 이 방법론을 개발했습니다. 우리는 프로모터, 오퍼레이터, 리보솜 결합 서열, 절연체 및 터미네이터에 적용될 수 있도록 보다 일반적인 형식으로 프로토콜을 제시했습니다. 이러한 유전적 부분은 각 설계에 대한 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 리포터 유전자의 5ʹ 또는 3ʹ 말단에 추가될 수 있으므로 테스트를 위한 각 변이체의 합성 또는 클로닝이 필요하지 않습니다. 생성된 PCR 산물은 리포터 단백질의 발현을 통한 평가를 위한 주형 DNA 역할을 합니다. 우리의 작업에서, 여기에 제공된 친화성 정제 프로토콜은 TetR 및 GamS에 사용되었다. 다른 억제 인자, 활성화 제, 중합 효소, 시그마 인자 및 관심있는 유전 적 부분에 대한 다른 단백질의 발현 및 정제에 동일한 절차를 사용할 수 있지만, 원하는 단백질이 발현되기 위해서는 변형이 필요할 수 있습니다. 이러한 단백질을 CFPS 반응으로 정제 및 적정하면 특정 유전적 부분의 보다 자세한 특성 분석이 가능합니다. 마지막으로, 수많은 대체 CFPS 프로토콜이 존재하며 각 프로토콜은 방법론의 부품 스크리닝 부분에 적합해야 합니다. 예로서, 우리는 이 프로토콜에 투석 단계를 포함하지 않으며, 다른 사람들은 천연 박테리아 프로모터22로부터의 발현에 대해 중요한 것으로 밝혀졌다. CFPS의 기본 구성 성분의 농도를 변경하는 것도 가능합니다. 액체 취급을 사용하면 처리량을 늘리고 필요한 재료를 줄임으로써 무수한 조건을 테스트하는 능력이 향상됩니다34,35.
상당한 문제 해결이 필요할 수 있는 한 가지 영역은 음향 액체 처리기의 최적화입니다. 음향 액체 처리기 디스펜싱은 이송되는 각 구성 요소에 맞게 최적화되어야 하며 데이터를 수집하기 전에 적절한 분포 및 재현성을 확인하기 위해 제어를 실행하는 것이 좋습니다. 이상적인 소스 플레이트 유형과 액체 등급 설정은 분배할 특정 액체와 그 구성 요소에 따라 다릅니다. 아민 코팅이 DNA와 상호 작용할 수 있으므로 아민 코팅 플레이트를 사용하여 DNA를 분배하는 것은 권장되지 않습니다. 또한, 특정 성분의 더 높은 농도를 분배하는 능력은 음향 액체 핸들러 모델에 의존할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 성공적인 액적 형성을 시각화하기 위해 호일 플레이트 씰에 분주하여 테스트 액체 이송을 수행할 수 있습니다. 그러나 이 테스트는 제한된 정보를 제공하며 다른 설정의 물방울이 동일하게 나타날 수 있습니다. 타르트라진과 같은 수용성 염료의 사용은 주어진 설정 또는 워크플로우에서 정확한 부피가 분배되는지 보다 정확하게 확인하는 데 사용될 수 있습니다( 대표 결과 참조). 액체 이송의 최적 프로그래밍은 생성 된 데이터의 정확성과 일관성에도 영향을 줄 수 있습니다. 하나의 소스 웰에서 하나의 목적지 웰로의 >1μL 전사의 경우, 체계적 웰 간 변동성을 줄이기 위해 ≤1μL의 순차적 이송을 프로그래밍해야 한다는 것을 발견했습니다(그림 4). 마지막으로, 이론적 및 실제 소스 우물 죽은 부피는 소스 플레이트 유형, 액체 등급 설정 및 특정 액체의 구성 요소에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 음향 액체 처리기 측량 기능을 사용하여 프로그램을 실행하기 전에 웰 부피를 평가하면 기기가 특정 액체를 얼마나 정확하게 측정할 수 있는지 측정하는 데 도움이 될 수 있습니다.
CFPS 반응 성능은 상이한 사용자, 재료의 배치, 플레이트 리더 및 실험실(41) 간의 결과를 비교할 때 변할 수 있다. 유전자 회로를 프로토타이핑하는 동안 이러한 비교가 필요한 경우, 실험 설정 전반에 걸쳐 결과를 정규화하는 데 도움이 되도록 각 반응 플레이트에 표준 구성 프로모터가 있는 내부 제어 반응을 포함하는 것이 좋습니다. DNA 준비 방법은 또한 CFPS 활성에 크게 기여할 수 있습니다. 에탄올 침전 단계를 포함하는 것이 좋습니다. 또한, 최적의 반응 조성은 추출물(34)의 배치에 의해 달라질 수 있다. 최적의 마그네슘 글루타메이트 및 칼륨 글루타메이트 농도는, 특히, 배치(42 ) 또는 사용된 프로모터 또는 리포터 단백질(24)에 의해 변하는 것으로 나타났다. 이러한 성분의 농도는 단백질 발현을 위한 최적 조건을 결정하기 위해 유전자 구축물 당 및 세포 추출물 제제당 각 성분의 여러 농도에 걸쳐 스크리닝함으로써 최적화되어야 합니다. 마지막으로, 일관된 CFPS 반응 성능을 위한 모범 사례에는 철저한 혼합, 신중한 피펫팅 및 각 시약 성분 준비의 일관성이 포함됩니다.
개별 부품의 특성화 외에도, 논리 회로(16) 또는 발진기(52, 53)와 같은 복잡한 회로를 형성하는 부품의 조합을 스크리닝하기 위해 동일한 방법이 사용될 수 있다. 이 방법은 역학 진단 54,55,56,57 또는 위험 감지 및 정량화3,58,59의 응용 분야를위한 바이오 센서를 스크리닝하고 최적화하는 데에도 적용 할 수 있습니다. 능동 학습(34)과 같은 AI 기반 기술의 적용은 또한 복잡한 생물학적 설계 공간의 신속한 탐색을 구동하기 위해 이 방법의 고처리량 특성과 결합될 수 있다. 궁극적으로, 우리는 합성 생물학에서 새로운 유전자 디자인의 개발 시간을 가속화하는 이 접근 방식을 구상하고 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 국방부 장관실의 과학 기술 우선 순위 발전 응용 연구 프로그램에 의해 가능했습니다. 사용된 sfGFP의 재고를 제공한 Scott Walper(해군 연구소)와 무세포 시스템을 사용한 프로토타이핑 및 음향 액체 취급의 관련 문제 해결과 관련된 유익한 토론을 해주신 Zachary Sun과 Abel Chiao(Tierra Biosciences)에게 감사드립니다.
2x YT medium | Sigma-Aldrich | Y2377-250G | Alternative to making 2xYT media |
Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | S30 Buffer B |
Agar | Bacto | 214010 | For plating cells |
Chromatography column (5 cm diameter) | BIO-RAD | 731-1550 | Used for protein purification. |
Destination plate | Thermo Scientific Nunc plate | 142761 | For CFPS reactions |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | For dialysis buffer |
DpnI | NEB | R0176L | For digestion of plasmid templates |
DTT | Roche | 20871723 | S30 Buffer B |
E. coli BL21(DE3) Rosetta2 | Novagen | 70954 | Cell line used for production of lysate and purified proteins |
Echo acoustic liquid handler | Labcyte | 525 | Acoustic liquid handler |
French pressure cell | Thermo Spectronic | FA-078 | For lysing cells for CFPS |
Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | For buffers |
Impermeable plastic sealable lid | Thermo | 232702 | Plate seal |
IPTG | RPI | I56000-25.0 | Used for protein induction. |
K-Glu | Sigma-Aldrich | g1501-500G | S30 Buffer B |
Labcyte Echo source plate | Labcyte | PL-05525 | For use with Echo acoustic liquid handler |
Mg-Glu | Sigma-Aldrich | 49605-250G | S30 Buffer B |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-250G | For buffers |
NaHPO4 | Sigma-Aldrich | 71505 | For dialysis buffer |
NaOH | Mallinckrodt Chemicals | 7708-10 | For making 2xYT media. Currently not produced by Mallinckrodt. Alternate: Sigma-Aldrich S0899 |
Ni-NTA resin | Invitrogen | R901-15 | For production of purified proteins |
PCR H2O | Ambion | AM9937 | PCR of linear templates |
Plate Reader | BioTek | H10 | Plate reader used |
Q5 PCR Master Mix | NEB | M0494S | PCR of linear templates |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28606 | PCR of linear templates |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR of linear templates |
QSonica Ultrasonic Processor | Qsonica | Q700 | Cell disruption during protein purification |
RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | Updated supplier from Sun et al. |
Tris | MP | 819623 | S30 Buffer B |
Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | For buffers |
Tryptone | Fluka | T7293 | For making 2xYT media |
Yeast Extract | Bacto | 212750 | For making 2xYT media |