تطوير عملية إنتاج وتنقية الفيروسات المرتبطة أدينو (AAV)2 ناقلات باستخدام نظام زراعة خلايا فيروس الحشرات Baculovirus
Summary
في هذا البروتوكول ، يتم إنتاج ناقل AAV2 عن طريق زراعة خلايا الحشرات Spodoptera frugiperda (Sf9) مع فيروس الكولو (BV) – AAV2 – بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) أو الجين العلاجي وBV-AAV2-rep-cap المصابة خلايا Sf9 في ثقافة التعليق. يتم تحرير جزيئات AAV من الخلايا باستخدام المنظفات ، وتوضيحها ، وتنقيتها عن طريق الكروماتوغرافيا عمود تقارب ، وتتركز عن طريق ترشيح تدفق عرضي.
Abstract
تعد الفيروسات المرتبطة بالأدينو (AAV) ناقلات واعدة لتطبيقات العلاج الجيني. هنا، يتم إنتاج ناقلات AAV2 من قبل الثقافة المشتركة للخلايا Spodoptera frugiperda (Sf9) مع خلايا Sf9 المصابة بفيروس الباكولو (BV) – AAV2 – GFP (أو الجينات العلاجية) وBV-AAV2-rep-cap في ثقافة التعليق الخالية من المصل. يتم استزراع الخلايا في قارورة في شاكر مداري أو مفاعل حيوي للموجة. لإطلاق جزيئات AAV ، يتم lysed الخلايا المنتجة في العازلة التي تحتوي على المنظفات ، والتي يتم توضيحها لاحقا عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة والترشيح. يتم تنقية جزيئات AAV من lysate الخلية باستخدام الكروماتوغرافيا عمود AVB Sepharose ، الذي يربط جزيئات AAV. يتم غسل الجسيمات المقيدة مع برنامج تلفزيوني لإزالة الملوثات و eluted من الراتنج باستخدام العازلة سيترات الصوديوم في pH 3.0. يتم تحييد الإيلوات الحمضي مع العازلة القلوية Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0)، المخفف مع المالحة العازلة بالفوسفات (PBS)، وتتركز بشكل أكبر مع ترشيح التدفق العرضي (TFF). يصف البروتوكول إنتاج ناقلات ما قبل السريرية على نطاق صغير متوافق مع التوسع في تصنيع AAV على نطاق واسع من الدرجة السريرية لتطبيقات العلاج الجيني البشري.
Introduction
الفيروسات المرتبطة أدينو (AAV) هي غير مغلفة parvoviruses الإنسان التي تحتوي على الحمض النووي واحد تقطعت بهم السبل من 4.6 kb. ناقلات AAV لها العديد من المزايا على ناقلات الفيروسية الأخرى لتطبيقات العلاج الجيني1،2،3،4. AAVs بشكل طبيعي النسخ المتماثل غير كفء، وبالتالي، تتطلب فيروس مساعد والآلات المضيفة للنسخ المتماثل. AAVs لا تسبب أي مرض وانخفاض المناعة في المضيف المصاب3،5. AAV يمكن أن تصيب كل من الخلايا هادئة وتقسيم بنشاط ويمكن أن تستمر كما episome دون الاندماج في الجينوم من الخلايا المضيفة (AAV نادرا ما تدمج في الجينوم المضيف)1،3. جعلت هذه الميزات AAV أداة مرغوبة لتطبيقات العلاج الجيني.
لتوليد ناقل نقل الجينات AAV، يتم استنساخ كاسيت المتحولين جنسيا، بما في ذلك الجين العلاجي، بين اثنين من التكرارات الطرفية الداخلية (ITRs)، والتي عادة ما تكون مشتقة من النمط المصلي AAV 2. الحد الأقصى لحجم من 5 ‘ITR إلى 3’ ITR، بما في ذلك تسلسل transgene، هو 4.6 كيلو بايت6. قد يكون لدى القبعات المختلفة خلية أو أنسجة مختلفة. لذلك ، يجب اختيار capsids استنادا إلى نوع الأنسجة أو الخلية المقصود استهدافه بمتجه AAV7.
وعادة ما تنتج ناقلات AAV المؤتلفة في خطوط خلايا الثدييات مثل خلايا الكلى الجنينية البشرية، HEK293 عن طريق العدوى العابرة لنقل نقل الجينات AAV، AAV إعادة الغطاء، ومساعد فيروس plasmids2،3. ومع ذلك، هناك العديد من القيود لإنتاج AAV على نطاق واسع عن طريق العدوى العابرة للخلايا HEK293 الملتصقة. أولا، هناك حاجة إلى عدد كبير من مداخن الخلايا أو زجاجات الأسطوانة. ثانيا، هناك حاجة إلى الحمض النووي عالي الجودة وواشف العدوى، مما يزيد من تكلفة التصنيع. وأخيرا، عند استخدام خلايا HEK293 الملتصقة، غالبا ما تكون هناك حاجة إلى المصل لإنتاج الأمثل، مما يعقد معالجة المصب1،2،3. طريقة بديلة لتصنيع AAV ينطوي على استخدام خط الخلية الحشرية، Spodoptera frugiperda (Sf9) الخلايا، وفيروس حشرة يسمى المؤتلف أوتوغرافا californica فيروس متعدد الكبسولات النووية متعددة الخلايا (AcMNPV أو فيروس baculovirus)8،9،10. تزرع خلايا Sf9 في ثقافة التعليق الخالية من المصل التي يسهل توسيع نطاقها وتتوافق مع إنتاج ممارسة التصنيع الجيدة الحالية (cGMP) على نطاق واسع ، والتي لا تتطلب بلازميد أو كاشفات العدوى. وعلاوة على ذلك، فإن تكلفة إنتاج AAV باستخدام نظام الفيروسات الكولوية Sf9 أقل من تكلفة استخدام العدوى العابرة للبلازميدات في خلايا HEK29311.
استخدم نظام إنتاج rAAV الأصلي باستخدام خلايا baculovirus-Sf9 ثلاثة فيروسات باكولو: فيروس باكولو واحد يحتوي على كاسيت نقل الجينات ، والثاني فيروس باكولو يحتوي على جين مندوب ، والثالث فيروس باكولو يحتوي على جين capsid خاص بالنمط المصلي12،13. ومع ذلك ، كان فيروس الباكولو الذي يحتوي على بناء مندوب غير مستقر وراثيا عند جولات متعددة من الممرات ، مما منع تضخيم فيروس الباكولو لإنتاج AAV على نطاق واسع. لحل هذه المشكلة، تم تطوير نظام ناقلات rAAV جديدة، والتي تحتوي على اثنين من الفيروسات الكولوجينية (TwoBac): واحد baculovirus تحتوي على كاسيت نقل الجينات AAV وآخر baculovirus تحتوي على الجينات AAV إعادة الغطاء معا والتي هي وراثيا أكثر استقرارا من النظام الأصلي وأكثر ملاءمة لإنتاج rAAV بسبب استخدام TwoBac بدلا من ثلاثة14، 15. يستخدم نظام OneBac كاسيت نقل الجينات AAV وجينات إعادة الغطاء في فيروس باكولو واحد وهو أكثر ملاءمة لإنتاج rAAV بسبب استخدام فيروس باكولو واحد بدلا من استخدام TwoBac أو ThreeBac2،16،17. في دراستنا ، تم استخدام نظام TwoBac للتحسين.
نظام الفيروسات الكولوية لإنتاج AAV له أيضا قيود: جزيئات فيروس الكولو غير مستقرة للتخزين على المدى الطويل في المتوسط الخالي من المصل11، وإذا كان تاتر فيروس الباكولو منخفضا ، ف هناك حاجة إلى كمية كبيرة من الفيروس الكولوفيروسي الفائق ، والتي قد تصبح سامة لنمو خلايا Sf9 أثناء إنتاج AAV (الملاحظة الشخصية). استخدام خلايا الحفاظ على الخلايا المصابة أقل تيتر وتوسيع نطاق (TIPS) الخلايا، أو خلايا الحشرات المصابة بفيروس الكولو (BIIC)، ويوفر خيارا جيدا لإنتاج AAV التي يتم إعداد خلايا Sf9 المصابة بفيروس الباكولو، cryopreserved، وتستخدم في وقت لاحق لعدوى خلايا Sf9 الطازجة. ميزة أخرى هي زيادة استقرار فيروس الباكولو (BV) في خلايا Sf9 بعد التبريد10،11.
يتم إنشاء نوعين من خلايا TIPS لتمكين إنتاج AAV: الأول عن طريق عدوى خلايا Sf9 مع BV-AAV2-GFP أو الجين العلاجي ، والثاني عن طريق عدوى خلية Sf9 مع BV-AAV2-rep-cap. يتم تقديم خلايا TIPS في الاقتباسات الصغيرة والجاهزة للاستخدام. يتم إنتاج ناقلات AAV في ثقافة التعليق الخالية من المصل في قارورة توضع في شاكر مداري أو مفاعل حيوي Wave عن طريق زراعة خلايا TIPS المشتركة التي تنتج الفيروسات الكولوئية وخلايا Sf9 الطازجة. يتم إصابة خلايا Sf9 بفيروسات الباكولو التي تحمل ناقل AAV2-GFP وتسلسلات إعادة الغطاء لتوليد AAV. بعد أربعة إلى خمسة أيام ، عندما تكون عوائد AAV هي الأعلى ، يتم زفر الخلايا المنتجة بالمنظفات لإطلاق جزيئات AAV. يتم توضيح lysate الخلية في وقت لاحق عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة والترشيح. يتم تنقية جزيئات AAV من اللستات بواسطة الكروماتوغرافيا عمود AVB Sepharose. وأخيرا، تتركز ناقلات AAV باستخدام TFF. يصف البروتوكول إنتاج AAV على نطاق صغير ، مفيد للأبحاث والدراسات ما قبل السريرية. ومع ذلك ، فإن الأساليب قابلة للتطوير ومتوافقة مع تصنيع ناقلات AAV من الدرجة السريرية لتطبيقات العلاج الجيني.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن تطبيق المعلمات المستخدمة في هذا البروتوكول لتطوير عملية إنتاج وتنقية وتركيز ناقلات AAV على كل من التصنيع الصغير والكبير لنواقل AAV لتطبيقات العلاج الجيني. يمكن تنفيذ عملية المنبع والمصب بالكامل في نظام مغلق متوافق مع ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (cGMP). المزايا الرئيسية لنظام الفيروسا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الدكتور روبرت م. كوتين (المعهد الوطني للقلب والدم والرئة، المعاهد القومية للصحة) على توفير بسخاء لنا البلازميدات AAV ودانييل ستيل وريبيكا ارنست (مستشفى سينسيناتي للأطفال) لمساعدتهم التقنية. ويدعم هذا العمل صندوق بدء التشغيل من مؤسسة سينسيناتي لأبحاث الأطفال إلى M.N.
Materials
| 1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| 2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
| 24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
| 250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
| AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
| Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
| Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
| Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
| Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
| Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
| Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
| Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
| Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
| Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
| WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
References
- Hildinger, M., Auricchio, A. Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders. European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).
- Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 122 (1), 23-36 (2013).
- Grieger, J. C., Samulski, R. J. Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps. Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups. Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 3, 16071 (2016).
- Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).
- Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System. Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).
- Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures. Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).
- Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors. Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Chen, H. Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells. Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).
- Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. Chromatography-based purification of adeno-associated virus. Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).
- Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).
- Wu, Y., et al. Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes. Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).
- Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).
- Joshi, P. R. H., et al. Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 21, 341-356 (2021).
- Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography. Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).
- Wright, J. F. Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies. Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).
- Tomono, T., et al. highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 11, 180-190 (2018).
