I detta protokoll produceras AAV2 vektor genom samodling Spodoptera frugiperda (Sf9) insektsceller med baculovirus (BV)-AAV2-grönt fluorescerande protein (GFP) eller terapeutisk gen och BV-AAV2-rep-cap infekterade Sf9 celler i suspension kultur. AAV-partiklar frigörs från cellerna med tvättmedel, förtydligas, renas genom affinitetskolonnkromatografi och koncentreras genom tangentiell flödesfiltrering.
Adeno-associerade virus (AAV) är lovande vektorer för genterapi applikationer. Här produceras AAV2 vektorn genom samkultur av Spodoptera frugiperda (Sf9) celler med Sf9 celler infekterade med baculovirus (BV)-AAV2-GFP (eller terapeutisk gen) och BV-AAV2-rep-cap i serumfri suspension kultur. Cellerna odlas i en kolv i en orbital shaker eller Wave bioreaktor. För att frigöra AAV-partiklarna lyses producentcellerna i buffertinnehållande tvättmedel, vilket därefter förtydligas genom centrifugering och filtrering med låg hastighet. AAV-partiklar renas från cellen lysate med hjälp av AVB Sepharose kolonnkromatografi, som binder AAV-partiklar. Bundna partiklar tvättas med PBS för att avlägsna föroreningar och eliseras från hartset med natriumcitratbuffert vid pH 3.0. Det sura eluat neutraliseras med alkalisk Tris-HCl-buffert (pH 8.0), späds ut med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och koncentreras ytterligare med tangentiell flödesfiltrering (TFF). Protokollet beskriver småskalig preklinisk vektorproduktion kompatibel med uppskalning till storskalig klinisk kvalitet AAV tillverkning för mänskliga genterapi applikationer.
Adenoassocierade virus (AAV) är icke-höljen mänskliga parvovirus som innehåller ett enda strandat DNA på 4,6 kb. AAV-vektorer har flera fördelar jämfört med andra virusvektorer för genterapiapplikationer1,2,3,4. AAV:er är naturligt replikerings inkompetenta och kräver därför ett hjälpvirus och värdmaskiner för replikering. AAV orsakar ingen sjukdom och har låg immunogenicitet i den infekterade värden3,5. AAV kan infektera både quiescent och aktivt dela celler och kan kvarstå som episome utan att integreras i genomet av värdcellerna (AAV integreras sällan i värdgenomet)1,3. Dessa funktioner har gjort AAV till ett önskvärt verktyg för genterapiapplikationer.
För att generera en AAV genöverföring vektor klonas transgenekassetten, inklusive den terapeutiska genen, mellan två interna terminalrepetitioner (ITR), som vanligtvis härrör från AAV serotyp 2. Den maximala storleken från 5′ ITR till 3′ ITR, inklusive transgenesekvensen, är 4,6 kb6. Olika kapsider kan ha en annan cell eller vävnad tropism. Därför bör kapsider väljas baserat på den vävnad eller celltyp som är avsedd att riktas mot AAV-vektorn7.
Rekombinanta AAV-vektorer produceras ofta i däggdjurs cellinjer såsom mänskliga embryonala njurceller, HEK293 genom övergående transfektion av AAV-genöverföringsvektorn, AAV rep-cap och helpervirusplasmider2,3. Det finns dock flera begränsningar för storskalig AAV-produktion genom transient transfektion av vidhäftande HEK293-celler. För det första behövs ett stort antal cellstackar eller rullflaskor. För det andra behövs högkvalitativt plasmid-DNA och transfektreagenser, vilket ökar tillverkningskostnaderna. Slutligen, när man använder vidhäftande HEK293-celler, behövs serumet ofta för optimal produktion, vilket komplicerar nedströmsbearbetning1,2,3. En alternativ metod för AAV-tillverkning innebär användning av insektscelllinjen, Spodoptera frugiperda (Sf9) celler och ett insektsvirus som kallas rekombinant Autographa californica multicapsid nukleär polyhedrosvirus (AcMNPV eller baculovirus)8,9,10. Sf9-celler odlas i serumfri suspensionskultur som är lätt att skala upp och är kompatibel med nuvarande god tillverkningssed (cGMP) produktion i stor skala, vilket inte kräver plasmid- eller transfektreagenser. Dessutom är kostnaden för AAV-produktionen med hjälp av Sf9-baculovirussystemet lägre än kostnaden för att använda transient transfektion av plasmider till HEK293-celler11.
Det ursprungliga rAAV-produktionssystemet med baculovirus-Sf9-celler använde tre baculovirus: ett baculovirus som innehåller genöverföringskassett, det andra baculoviruset som innehåller repgenen och det tredje baculoviruset som innehåller serotypspecifik kapsidgen12,13. Baculoviruset som innehåller rep konstruktion var dock genetiskt instabila på flera rundor av passager, vilket förhindrade förstärkning av baculovirus för storskalig AAV produktion. För att lösa detta problem utvecklades ett nytt rAAV-vektorsystem, som innehöll två baculovirus (TwoBac): ett baculovirus som innehåller AAV-genöverföringskasetten och ett annat baculovirus som innehåller AAV rep-cap gener tillsammans som är genetiskt stabilare än det ursprungliga systemet och bekvämare att producera rAAV på grund av att använda TwoBac istället för tre14, 15. OneBac-systemet använder AAV-genöverföringskassetten och rep-cap-generna i ett enda baculovirus som är bekvämare att producera rAAV på grund av att använda ett baculovirus istället för att använda TwoBac eller ThreeBac2,16,17. I vår studie användes TwoBac-systemet för optimering.
Baculovirussystemet för AAV-produktion har också begränsningar: baculoviruspartiklar är instabila för långvarig lagring i serumfritt medium11, och om baculovirustitern är låg behövs en stor volym baculovirus supernatant, vilket kan bli giftigt för tillväxten av Sf9-celler under AAV-produktion (personlig observation). Användningen av titerfria infekterade cellkonserverings- och uppskalningsceller (TIPS), eller baculovirusinfekterade insektsceller (BIIC), ger ett bra alternativ för AAV-produktion där baculovirusinfekterade Sf9-celler bereds, kryopreserveras och därefter används för infektion av färska Sf9-celler. En annan fördel är den ökade stabiliteten hos baculovirus (BV) i Sf9-celler efter kryopreservation10,11.
Två typer av TIPS-celler genereras för att möjliggöra AAV-produktion: den första genom infektion av Sf9-celler med BV-AAV2-GFP eller terapeutisk gen, och den andra genom infektion av Sf9-cellen med BV-AAV2-rep-cap. TIPS-celler är kryopreserverade i små och färdiga alikvoter. AAV-vektorer produceras i serumfri suspensionskultur i en kolv placerad i en orbital shaker eller Wave bioreaktor genom att samkultera TIPS-celler som producerar baculovirus och färska Sf9-celler. Sf9-celler infekteras av baculovirus som bär AAV2-GFP-vektorn och rep-cap-sekvenserna för att generera AAV. Fyra till fem dagar senare, när AAV-avkastningen är den högsta, är producentcellerna lysda med tvättmedel för att frigöra AAV-partiklarna. Cell lysate förtydligas därefter genom låg hastighet centrifugering och filtrering. AAV-partiklar renas från lysat av AVB Sepharose kolonnkromatografi. Slutligen koncentreras AAV-vektorer med TFF. Protokollet beskriver produktionen av AAV i liten skala, användbar för forskning och prekliniska studier. Metoderna är dock skalbara och kompatibla med tillverkning av kliniska AAV-vektorer för genterapiapplikationer.
De parametrar som används i detta protokoll för processutveckling av produktion, rening och koncentration av AAV-vektorer kan tillämpas på både liten och storskalig tillverkning av AAV-vektorer för genterapiapplikationer. Hela processen uppströms och nedströms kan utföras i ett slutet system som är kompatibelt med den nuvarande goda tillverkningsseden (cGMP). De stora fördelarna med Sf9-baculovirussystemet är skalbarhet för storskalig AAV-produktion av GMP-klass till en överkomlig kostnad. Systemet behöver…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dr. Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) för att generöst ge oss AAV-plasmiderna och Danielle Steele och Rebecca Ernst (Cincinnati Children’s Hospital) för deras tekniska hjälp. Detta arbete stöds av startfonden från Cincinnati Children’s Research Foundation till M.N.
1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |