JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생체공학

Constructie van modellipidenmembranen met G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's)

Published: February 05, 2022
doi:
10.3791/62830
, ,
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science,University of Southern California

Summary

Dit protocol maakt gebruik van agarose zwelling als een krachtige en generaliseerbare techniek voor het opnemen van integrale membraaneiwitten (GMP’s) in gigantische unilamellaire lipide blaasjes (GUVs), zoals hier beschreven voor de reconstructie van het menselijke 1A serotoninereceptoreiwit (5-HT1AR), een van de klassen van farmacologisch belangrijke G-eiwit-gekoppelde receptoren.

Abstract

Robuust in vitro onderzoek naar de structuur en functie van integrale membraaneiwitten is een uitdaging geweest vanwege de complexiteit van het plasmamembraan en de vele factoren die het eiwitgedrag in levende cellen beïnvloeden. Giant unilamellar blaasjes (GUVs) zijn een biomimetisch en zeer afstembaar in vitro modelsysteem voor het onderzoeken van eiwit-membraaninteracties en het onderzoeken van eiwitgedrag op een precieze, stimulusafhankelijke manier. In dit protocol presenteren we een goedkope en effectieve methode voor het fabriceren van GUVs met de menselijke serotonine 1A-receptor (5-HT1AR) stabiel geïntegreerd in het membraan. We fabriceren GUVs met behulp van een gemodificeerde hydrogel-zwellingsmethode; door een lipidefilm af te zetten bovenop een mengsel van agarose en 5-HT1AR en vervolgens het hele systeem te hydrateren, kunnen blaasjes worden gevormd met goed georiënteerde en functionele 5-HT1AR opgenomen in het membraan. Deze GUVs kunnen vervolgens worden gebruikt om eiwit-membraaninteracties en lokalisatiegedrag via microscopie te onderzoeken. Uiteindelijk kan dit protocol ons begrip van de functionaliteit van integrale membraaneiwitten bevorderen, wat diepgaande fysiologische inzichten oplevert.

Introduction

Synthetische modelmembranen zijn krachtige hulpmiddelen bij het onderzoeken van de fundamentele eigenschappen en functies van biomembranen. Gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs) zijn een van de meest prominente platforms om een verscheidenheid aan plasmamembraaneigenschappen te bestuderen en kunnen worden ontworpen om verschillende fysiologische omstandigheden na te bootsen1,2,3,4,5,6,7,8. Het is algemeen bekend dat het plasmamembraan en zijn organisatie een sleutelrol spelen in een groot aantal cellulaire processen, zoals signaaltransductie, adhesie, endocytose en transport9,10,11,12,13,14,15.

GUV’s zijn vervaardigd met behulp van verschillende methoden, waaronder zachte hydratatie16, hydrogel zwelling17, elektroformatie18, microfluïdische technieken19,20,21,22, jetting23 en oplosmiddeluitwisseling24,25,26. Vanwege uitdagingen bij het omgaan met integrale membraaneiwitten (GMP’s), zijn in vitro platforms om ze te bestuderen beperkt. GUV’s bieden een vereenvoudigd platform voor het bestuderen van GMP’s in een omgeving die hun oorspronkelijke omgeving nabootst. Hoewel er verschillende benaderingen zijn geweest voor eiwitreconstitutie in GUV’s, ontstaan er uitdagingen door het opnemen van eiwitten met de juiste oriëntatie en het behoud van eiwitfunctionaliteit27.

De meest succesvolle eiwitreconstitutie in GUV’s vereist de detergentenuitwisselingsmethode; waarbij de eiwitten uit hun oorspronkelijke omgeving worden opgelost door detergentia, gevolgd door eiwitzuivering en vervolgens de wasmiddelmoleculen via verschillende methoden worden vervangen door lipiden28. Terwijl detergentia dienen om de tertiaire structuur van GMP’s tijdens de zuivering te stabiliseren, zijn wasmiddelmicellen een relatief onnatuurlijke omgeving voor deze eiwitten, die beter gestabiliseerd zijn, met name voor functionele studies, in lipide bilayers28,29,30. Bovendien was het opnemen van functionele transmembraaneiwitten in de lipide bilayer met behulp van traditionele GUV-fabricagetechnieken moeilijk vanwege de grootte, de delicatesse van deze eiwitten en de extra reinigingsmiddeluitwisselingsstappen die nodig zouden zijn27,31,32,33. Het gebruik van organisch oplosmiddel om reinigingsmiddelen te verwijderen veroorzaakt eiwitaggregatie en denaturering34. Een verbeterde detergent-gemedieerde methode is veelbelovend, maar voorzichtigheid is geboden voor de reinigingsmiddelverwijderingsstap en optimalisatie kan nodig zijn voor specifieke eiwitten31,35. Bovendien kunnen methoden die elektroformatie gebruiken de keuze van eiwitten beperken en mogelijk niet geschikt zijn voor alle lipidesamenstellingen, met name geladen lipiden31,36,37. Een andere techniek die is gebruikt, is peptide-geïnduceerde fusie van grote unilamellaire blaasjes (LUVs) die het gewenste eiwit met GUVs bevatten, hoewel het bewerkelijk bleek te zijn en kan leiden tot het inbrengen van vreemde moleculen – de fusogene peptiden33,38,39. Gigantische plasmamembraanblaasjes (GPMV’s), die zijn afgeleid van levende cellen, kunnen worden gebruikt om sommige van deze problemen te overwinnen, maar ze maken minimale controle mogelijk over de resulterende lipide- en eiwitsamenstelling14,40,41. Daarom biedt de integratie van GMP’s in de bilipide laag van GUVs met behulp van onze gemodificeerde agarose-zwellingsmethode een betrouwbare methode om deze eiwitten in de membraanomgeving verder te onderzoeken42,43,44,45.

Cellulaire signalering en communicatie omvat een familie van eiwitten die bekend staat als G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR’s); GPCR’s behoren tot de grootste familie van eiwitten en worden geassocieerd met het moduleren van stemming, eetlust, bloeddruk, cardiovasculaire functie, ademhaling en slaap onder vele andere fysiologische functies46. In deze studie gebruikten we de menselijke serotonine 1A-receptor (5-HT1AR), een prototypisch lid van de GPCR-familie. 5-HT1AR kan worden gevonden in het centrale zenuwstelsel (CZS) en bloedvaten; het beïnvloedt tal van functies zoals cardiovasculaire, gastro-intestinale, endocriene functies, evenals deelname aan de regulatie van mood47. Een grote barrière voor GPCR-onderzoek komt voort uit hun complexe amfifiele structuur en GUVs bieden een veelbelovend platform voor het onderzoek naar verschillende interessante eigenschappen, variërend van eiwitfunctionaliteit, lipide-eiwitinteracties en eiwit-eiwitinteracties. Verschillende benaderingen zijn gebruikt om lipide-eiwitinteracties te bestuderen, zoals oppervlakteplasmonresonantie (SPR)48,49, nucleaire magnetische resonantiespectroscopie (NMR)50,51, eiwitlipidenoverlay (PLO) assay51,52,53,54, inheemse massaspectrometrie55, isotherme titratiecalorimetrie (ITC)56,57 en liposoom sedimentatietest58,59. Ons laboratorium heeft de vereenvoudigde GUV-benadering gebruikt om het effect van lipide-eiwitinteracties op de eiwitfunctionaliteit te onderzoeken door BODIPY-GTPγS in te kapselen, dat bindt met de Giα-subeenheid in de actieve toestand van de receptor. Hun binding maakt de fluorofoor los en produceert een fluorescentiesignaal dat in de loop van de tijd kan worden gedetecteerd45. Bovendien onderzochten verschillende studies lipide-eiwitinteracties en de rol van eiwitten bij het detecteren of stabiliseren van membraankromming60,61, en het gebruik van een haalbare GUV-aanpak zou een belangrijk voordeel kunnen zijn.

Dit protocol demonstreert een eenvoudige methode om GPCR’s op te nemen in het membraan van GUVs met behulp van een gemodificeerd agarose hydrogel-systeem17,42. Bovendien zou onze methode, op basis van ons eerdere werk, geschikt kunnen zijn voor GMP’s die kortdurende blootstelling aan 30-40 °C kunnen verdragen. Kortom, we verspreiden een dunne film van agarose in combinatie met membraanfragmenten die de GPCR van belang bevatten. Na het doseren van deze laag zetten we een lipideoplossing af bovenop de agarose en laten we het oplosmiddel verdampen. Rehydratatie van het systeem werd vervolgens uitgevoerd met een waterige buffer, wat resulteerde in de vorming van GUVs met eiwit opgenomen in de lipide bilayer.

Protocol

1. Eiwitetikettering Laat NHS-Rhodamine, 5-HT1A membraanfragmenten en één 7 K MWCO spin ontzoutingskolom bij kamertemperatuur in evenwicht brengen. Los 1 mg NHS-rhodamine op in 100 μL dimethylsulfoxide (DMSO). Voeg 5 μL natriumbicarbonaatoplossing van 1 M toe om de pH van de 5-HT1AR-oplossing te verhogen tot pH 8. Voeg 3,66 μL van de NHS-rhodamine-oplossing toe aan 50 μL van de 5-HT1AR-oplossing en pipetteer voorzichtig op en neer in een micro…

Representative Results

De concentratie van eiwit werd gemeten en de mate van etikettering werd berekend als de molaire verhouding tussen de kleurstof en het eiwit op 1:1. Door de GUVs te onderzoeken met behulp van confocale microscopie, konden we een succesvolle vorming en eiwitintegratie van de blaasjes bevestigen. De lipiden werden gelabeld met 0,4 mol% ATTO 488-DPPE en het eiwit werd covalent gelabeld via rhodamine NHS-estermodificatie van primaire amines. Figuur 2a en figuur 2b to…

Discussion

We hebben twee stappen geïdentificeerd die van cruciaal belang zijn voor het succes van het algemene protocol: plasmabehandeling en lipideafzetting. Plasmareiniging van de coverslips is essentieel om ervoor te zorgen dat er voldoende dekking en hechting van de agarose hydrogel op de glazen afdekplaat is. Plasmareiniging bereikt twee dingen: ten eerste verwijdert het sporen van organisch materiaal van het glasoppervlak; ten tweede activeert het het dekvloeroppervlak, waardoor de bevochtigbaarheid toeneemt naarmate de hyd…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Matthew Blosser voor de waardevolle discussie en het advies. Dit werk werd ondersteund door het Office of Naval Research (N00014-16-1-2382) en de National Science Foundation (PHY-1915017).

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850375C-25mg
 TI-Eclipse inverted microscope Nikon, Melville, NY Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings Sterling Seal & Supply, Neptune, IN 5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera Photometrics, Huntington Beach, CA  Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm Coherent, Santa Clara, CA 488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments Perkin Elmer, Waltham, MA RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) ATTO-TEC, Siegen, Germany AD 488-155
Bench top plasma cleaner Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-32G
bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich, St. Louis, MO A9418
chloroform (CHCl3) Millipore Sigma, Burlington, MA CX1055
Cholesterol (Chol) Sigma Aldrich, St. Louis, MO C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom Corning, Corning, NY 3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic Elma, Singen, Germany [no longer sold on main website]
glucose Sigma Aldrich, St. Louis, MO G7528
methanol (MeOH) Millipore Sigma, Burlington, MA MX0485
NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ND-1000
NHS-Rhodamine Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) Corning, Corning, NY 21-040
spinning-disc CSUX confocal head Yokogawa,Tokyo, Japan CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips ChemGlass, Vineland, NJ CLS-1760
sucrose Sigma Aldrich, St. Louis, MO S7903
Sykes-Moore chambers Bellco, Vineland, NJ 1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5030
VWR Analog Heatblock VWR International, Radnor, PA [no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator VWR International, Radnor, PA 10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 89882
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9, 467-508 (1980).
  2. Mouritsen, O. G. Model answers to lipid membrane questions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), 004622 (2011).
  3. Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  4. Li, S., Hu, P., Malmstadt, N. Confocal imaging to quantify passive transport across biomimetic lipid membranes. Analytical Chemistry. 82 (18), 7766-7771 (2010).
  5. Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2010).
  6. Elbaradei, A., Brown, S. L., Miller, J. B., May, S., Hobbie, E. K. Interaction of polymer-coated silicon nanocrystals with lipid bilayers and surfactant interfaces. Physical Review E. 94 (4), 042804 (2016).
  7. Veatch, S. L., Keller, S. L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Physical Review Letters. 89 (26), 268101 (2002).
  8. Plasencia, I., Norlén, L., Bagatolli, L. A. Direct visualization of lipid domains in human skin stratum corneum’s lipid membranes: Effect of pH and temperature. Biophysical Journal. 93 (9), 3142-3155 (2007).
  9. Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophysical Journal. 80 (3), 1417-1428 (2001).
  10. Deans, J. P., Li, H., Polyak, M. J. CD20-mediated apoptosis: signalling through lipid rafts. Immunology. 107 (2), 176-182 (2002).
  11. Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 32, 257-283 (2003).
  12. Pike, L. J. Lipid rafts: bringing order to chaos. Journal of Lipid Research. 44 (4), 655-667 (2003).
  13. Tsui-Pierchala, B. A., Encinas, M., Milbrandt, J., Johnson, E. M. Lipid rafts in neuronal signaling and function. Trends in Neurosciences. 25 (8), 412-417 (2002).
  14. Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
  15. Scheve, C. S., Gonzales, P. A., Momin, N., Stachowiak, J. C. Steric pressure between membrane-bound proteins opposes lipid phase separation. Journal of the American Chemical Society. 135 (4), 1185-1188 (2013).
  16. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  17. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of agarose enable rapid formation of giant liposomes in solutions of physiologic ionic strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  18. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  19. Teh, S. -. Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), (2011).
  20. Hu, P. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic fabrication of asymmetric giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (5), 1434-1440 (2011).
  21. Lu, L., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Continuous microfluidic fabrication of synthetic asymmetric vesicles. Lab on a Chip. 15 (17), 3591-3599 (2015).
  22. Maktabi, S., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Dewetting-induced formation and mechanical properties of synthetic bacterial outer membrane models (GUVs) with controlled inner-leaflet lipid composition. Soft Matter. 15 (19), 3938-3948 (2019).
  23. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  24. Kim, S., Martin, G. M. Preparation of cell-size unilamellar liposomes with high captured volume and defined size distribution. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 646 (1), 1-9 (1981).
  25. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  26. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. le Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  29. Rigaud, J. -. L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods in Enzymology. 372, 65-86 (2003).
  30. Renthal, R. An unfolding story of helical transmembrane proteins. 생화학. 45 (49), 14559-14566 (2006).
  31. Jørgensen, I. L., Kemmer, G. C., Pomorski, T. G. Membrane protein reconstitution into giant unilamellar vesicles: a review on current techniques. European Biophysics Journal. 46 (2), 103-119 (2017).
  32. Hansen, J. S., et al. Formation of giant protein vesicles by a lipid cosolvent method. ChemBioChem. 12 (18), 2856-2862 (2011).
  33. Kahya, N., Pécheur, E. -. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
  34. Kahya, N., Merkle, D., Schwille, P. Pushing the complexity of model bilayers: Novel prospects for membrane biophysics. Fluorescence of Supermolecules, Polymers, and Nanosystems. , 339-359 (2008).
  35. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Lévy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  36. Shaklee, P. M., et al. Protein incorporation in giant lipid vesicles under physiological conditions. ChemBioChem. 11 (2), 175-179 (2010).
  37. Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1712 (2), 152-160 (2005).
  38. Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 87 (1), 419-429 (2004).
  39. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  40. Levental, I., et al. Cholesterol-dependent phase separation in cell-derived giant plasma-membrane vesicles. The Biochemical Journal. 424 (2), 163-167 (2009).
  41. López-Montero, I., Rodríguez-García, R., Monroy, F. Artificial spectrin shells reconstituted on giant vesicles. The Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (12), 1583-1588 (2012).
  42. Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. Journal of the American Chemical Society. 135 (46), 17294-17297 (2013).
  43. Gutierrez, M. G., Malmstadt, N. Human serotonin receptor 5-HT 1A preferentially segregates to the liquid disordered phase in synthetic lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13530-13533 (2014).
  44. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  45. Gutierrez, M. G., Mansfield, K. S., Malmstadt, N. The functional activity of the human serotonin 5-HT 1A receptor is controlled by lipid bilayer composition. Biophysical Journal. 110, 2486-2495 (2016).
  46. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
  47. Nichols, D. E., Nichols, C. D. Serotonin receptors. Chemical Reviews. 108 (5), 1614-1641 (2008).
  48. Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using surface plasmon resonance to quantitatively assess lipid-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1376, 141-153 (2016).
  49. Place, J. F., Sutherland, R. M., Dähne, C. Opto-electronic immunosensors: a review of optical immunoassay at continuous surfaces. Biosensors. 1 (4), 321-353 (1985).
  50. Brown, M. F., Miljanich, G. P., Franklin, L. K., Dratz, E. A. H-NMR studies of protein-lipid interactions in retinal rod outer segment disc membranes. FEBS letters. 70 (1), 56-60 (1976).
  51. Sun, F., et al. Structural basis for interactions of the Phytophthora sojae RxLR effector Avh5 with phosphatidylinositol 3-phosphate and for host cell entry. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (3), 330-344 (2013).
  52. Kavran, J. M., et al. Specificity and promiscuity in phosphoinositide binding by pleckstrin homology domains. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30497-30508 (1998).
  53. Stevenson, J. M., Perera, I. Y., Boss, W. F. A phosphatidylinositol 4-Kinase pleckstrin homology domain that binds phosphatidylinositol 4-Monophosphate. Journal of Biological Chemistry. 273 (35), 22761-22767 (1998).
  54. Han, X., Yang, Y., Zhao, F., Zhang, T., Yu, X. An improved protein lipid overlay assay for studying lipid-protein interactions. Plant Methods. 16 (1), 33 (2020).
  55. Yen, H. -. Y., et al. PtdIns(4,5)P 2 stabilizes active states of GPCRs and enhances selectivity of G-protein coupling. Nature. 559 (7714), 423-427 (2018).
  56. Myers, M., Mayorga, O. L., Emtage, J., Freire, E. Thermodynamic characterization of interactions between ornithine transcarbamylase leader peptide and phospholipid bilayer membranes. 생화학. 26 (14), 4309-4315 (1987).
  57. Swamy, M. J., Sankhala, R. S. Probing the thermodynamics of protein-lipid interactions by isothermal titration calorimetry. Lipid-Protein Interactions: Methods and Protocols. , 37-53 (2013).
  58. Han, X., Shi, Y., Liu, G., Guo, Y., Yang, Y. Activation of ROP6 GTPase by phosphatidylglycerol in arabidopsis. Frontiers in Plant Science. , (2018).
  59. Surolia, A., Bachhawat, B. K. The effect of lipid composition on liposome-lectin interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 83 (3), 779-785 (1978).
  60. Sarkis, J., Vié, V. Biomimetic models to investigate membrane biophysics affecting lipid-protein interaction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 270 (2020).
  61. McMahon, H. T., Boucrot, E. Membrane curvature at a glance. Journal of Cell Science. 128 (6), 1065-1070 (2015).
  62. Banerjee, K. K., Kumar, S., Bremmell, K. E., Griesser, H. J. Molecular-level removal of proteinaceous contamination from model surfaces and biomedical device materials by air plasma treatment. Journal of Hospital Infection. 76 (3), 234-242 (2010).
  63. Raiber, K., Terfort, A., Benndorf, C., Krings, N., Strehblow, H. -. H. Removal of self-assembled monolayers of alkanethiolates on gold by plasma cleaning. Surface Science. 595 (1), 56-63 (2005).
  64. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A 2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  65. Garten, M., Levy, D., Bassereau, P. The giant vesicle book. The giant vesicle book. , 38-51 (2021).
  66. Gutierrez, M. G., et al. G Protein-coupled receptors incorporated into rehydrated diblock copolymer vesicles retain functionality. Small. 12 (38), 5256-5260 (2016).
  67. Peruzzi, J., Gutierrez, M. G., Mansfield, K., Malmstadt, N. Dynamics of hydrogel-assisted giant unilamellar vesicle formation from unsaturated lipid systems. Langmuir. 32 (48), 12702-12709 (2016).
  68. Shchelokovskyy, P., Tristram-Nagle, S., Dimova, R. Effect of the HIV-1 fusion peptide on the mechanical properties and leaflet coupling of lipid bilayers. New Journal of Physics. 13, 025004 (2011).

Tags

GUVsGiant Unilamellar VesiclesMembrane ProteinsGPCRsG Protein-coupled Receptors5-HT1ARSerotonin ReceptorHydrogel ScaffoldLipid MembraneProtein IncorporationBiomimetic ModelIn Vitro Studies
check_url/kr/62830?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C., Malmstadt, N. Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs). J. Vis. Exp. (180), e62830, doi:10.3791/62830 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image