यह प्रोटोकॉल अभिन्न झिल्ली प्रोटीन (आईएमपी) को विशाल यूनिलैमेलर लिपिड पुटिकाओं (जीयूवी) में शामिल करने के लिए एक शक्तिशाली और सामान्य तकनीक के रूप में एगारोज़ सूजन का उपयोग करता है, जैसा कि मानव 1 ए सेरोटोनिन रिसेप्टर प्रोटीन (5-HT1AR) के पुनर्गठन के लिए यहां वर्णित है, जो औषधीय रूप से महत्वपूर्ण जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स के वर्गों में से एक है।
अभिन्न झिल्ली प्रोटीन की संरचना और कार्य की मजबूत इन विट्रो जांच प्लाज्मा झिल्ली की जटिलताओं और जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन व्यवहार को प्रभावित करने वाले कई कारकों के कारण एक चुनौती रही है। विशालकाय यूनिलैमेलर पुटिकाएं (GUVs) प्रोटीन-झिल्ली इंटरैक्शन की जांच करने और एक सटीक, उत्तेजना-निर्भर तरीके से प्रोटीन व्यवहार की जांच करने के लिए एक बायोमिमेटिक और अत्यधिक ट्यूनेबल इन विट्रो मॉडल सिस्टम हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम मानव सेरोटोनिन 1 ए रिसेप्टर (5-HT1AR) के साथ GUVs को बनाने के लिए एक सस्ती और प्रभावी विधि प्रस्तुत करते हैं जो झिल्ली में स्थिर रूप से एकीकृत होता है। हम एक संशोधित हाइड्रोजेल सूजन विधि का उपयोग करके जीयूवी का निर्माण करते हैं; agarose और 5-HT1AR के मिश्रण के शीर्ष पर एक लिपिड फिल्म जमा करके और फिर पूरे सिस्टम को हाइड्रेट करके, पुटिकाओं को झिल्ली में शामिल ठीक से उन्मुख और कार्यात्मक 5-HT1AR के साथ बनाया जा सकता है। इन GUVs का उपयोग तब माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्रोटीन-झिल्ली इंटरैक्शन और स्थानीयकरण व्यवहार की जांच करने के लिए किया जा सकता है। आखिरकार, यह प्रोटोकॉल अभिन्न झिल्ली प्रोटीन की कार्यक्षमता की हमारी समझ को आगे बढ़ा सकता है, जो गहन शारीरिक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।
सिंथेटिक मॉडल झिल्ली बायोमेम्ब्रेन के मौलिक गुणों और कार्यों की जांच में शक्तिशाली उपकरण हैं। विशालकाय यूनिलैमेलर पुटिकाएं (GUVs) प्लाज्मा झिल्ली गुणों की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए सबसे प्रमुख प्लेटफार्मों में से एक हैं और विभिन्न शारीरिक स्थितियों की नकल करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है1,2,3,4,5,6,7,8। यह अच्छी तरह से स्थापित है कि प्लाज्मा झिल्ली और इसका संगठन सेलुलर प्रक्रियाओं की एक भीड़ में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जैसे कि सिग्नल ट्रांसडक्शन, आसंजन, एंडोसाइटोसिस, और परिवहन 9,10,11,12,13,14,15।
GUVs को कोमल जलयोजन 16, हाइड्रोजेल सूजन 17, इलेक्ट्रोफॉर्मेशन 18, माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक19,20,21,22, जेटिंग 23, और विलायक एक्सचेंज 24,25,26 सहित विभिन्न तरीकों का उपयोग करके गढ़ा गया है। अभिन्न झिल्ली प्रोटीन (आईएमपी) को संभालने में चुनौतियों के कारण, उनका अध्ययन करने के लिए इन विट्रो प्लेटफॉर्म सीमित हैं। GUVs एक ऐसे वातावरण में आईएमपी का अध्ययन करने के लिए एक सरलीकृत मंच प्रस्तुत करते हैं जो उनके मूल वातावरण की नकल करता है। यद्यपि GUVs में प्रोटीन पुनर्गठन के लिए कई दृष्टिकोण रहे हैं, लेकिन सही अभिविन्यास के साथ प्रोटीन को शामिल करने और प्रोटीन कार्यक्षमता को बनाए रखने से चुनौतियां उत्पन्न होती हैं27।
जीयूवी में सबसे सफल प्रोटीन-पुनर्गठन के लिए डिटर्जेंट विनिमय विधि की आवश्यकता होती है; जिसमें डिटर्जेंट द्वारा अपने मूल वातावरण से प्रोटीन को घुलनशील बनाना शामिल है, इसके बाद प्रोटीन शुद्धिकरण, और फिर डिटर्जेंट अणुओं को विभिन्न तरीकों के माध्यम से लिपिड के साथ बदलना। जबकि डिटर्जेंट शुद्धिकरण के दौरान आईएमपी की तृतीयक संरचना को स्थिर करने के लिए काम करते हैं, डिटर्जेंट मिसेल इन प्रोटीनों के लिए एक अपेक्षाकृत अप्राकृतिक वातावरण हैं, जो लिपिड बाईलेयर 28,29,30 में विशेष रूप से कार्यात्मक अध्ययन के लिए बेहतर स्थिर होते हैं। इसके अलावा, पारंपरिक जीयूवी निर्माण तकनीकों का उपयोग करके लिपिड बाईलेयर में कार्यात्मक ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन को शामिल करना आकार, इन प्रोटीनों की विनम्रता और अतिरिक्त डिटर्जेंट विनिमय चरणों के कारण मुश्किल हो गया है जो 27,31,32,33 की आवश्यकता होगी। डिटर्जेंट को हटाने के लिए कार्बनिक विलायक का उपयोग प्रोटीन एकत्रीकरण और विकृतीकरण का कारण बनता है34। एक बेहतर डिटर्जेंट-मध्यस्थता विधि आशाजनक रही है, हालांकि, डिटर्जेंट हटाने के चरण के लिए सावधानी बरतने की आवश्यकता है और विशिष्ट प्रोटीन 31,35 के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। इसके अतिरिक्त, इलेक्ट्रोफॉर्मेशन का उपयोग करने वाले तरीके प्रोटीन की पसंद को प्रतिबंधित कर सकते हैं और सभी लिपिड रचनाओं के लिए उपयुक्त नहीं हो सकते हैं, विशेष रूप से चार्ज किए गए लिपिड 31,36,37। एक और तकनीक जिसका उपयोग किया गया है वह है पेप्टाइड-प्रेरित बड़े यूनिलैमेलर पुटिकाओं (एलयूवी) का संलयन जिसमें जीयूवी के साथ वांछित प्रोटीन होता है, हालांकि यह श्रमसाध्य पाया गया था और विदेशी अणुओं के सम्मिलन का कारण बन सकता है- फ्यूसोजेनिक पेप्टाइड्स 33,38,39। विशाल प्लाज्मा झिल्ली पुटिकाओं (जीपीएमवी), जो जीवित कोशिकाओं से व्युत्पन्न होते हैं, का उपयोग इन मुद्दों में से कुछ को दूर करने के लिए किया जा सकता है, हालांकि वे परिणामी लिपिड और प्रोटीन संरचना के न्यूनतम नियंत्रण की अनुमति देते हैं14,40,41। इसलिए, हमारे संशोधित agarose सूजन विधि का उपयोग कर GUVs की bilipid परत में IMPs का एकीकरण झिल्ली पर्यावरण में इन प्रोटीनों की आगे की जांच करने के लिए एक विश्वसनीय विधि प्रस्तुत करता है42,43,44,45.
सेलुलर सिग्नलिंग और संचार में प्रोटीन का एक परिवार शामिल है जिसे जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) के रूप में जाना जाता है; GPCRs प्रोटीन के सबसे बड़े परिवार में से एक हैं और कई अन्य शारीरिक कार्यों के बीच मनोदशा, भूख, रक्तचाप, हृदय समारोह, श्वसन और नींद को मॉड्युलेट करने के साथ जुड़े हुए हैं। इस अध्ययन में, हमने मानव सेरोटोनिन 1 ए रिसेप्टर (5-एचटी 1 एआर) का उपयोग किया जो जीपीसीआर परिवार का एक प्रोटोटाइप सदस्य है। 5-HT1AR केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) और रक्त वाहिकाओं में पाया जा सकता है; यह कार्डियोवैस्कुलर, जठरांत्र संबंधी, अंतःस्रावी कार्यों जैसे कई कार्यों को प्रभावित करता है, साथ ही साथ मूड 47 के विनियमन में भाग लेता है। जीपीसीआर अनुसंधान के लिए एक बड़ी बाधा उनकी जटिल एम्फीफिलिक संरचना से उत्पन्न होती है, और जीयूवी प्रोटीन कार्यक्षमता, लिपिड-प्रोटीन इंटरैक्शन और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन से लेकर ब्याज के विभिन्न गुणों की जांच के लिए एक आशाजनक मंच प्रस्तुत करते हैं। लिपिड-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया गया है जैसे कि सतह प्लास्मोन अनुनाद (एसपीआर) 48,49, परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएमआर)50,51, प्रोटीन लिपिड ओवरले (पीएलओ) परख51,52,53,54, देशी मास स्पेक्ट्रोमेट्री 55, समतापी अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी) 56,57, और लिपोसोम अवसादन परख58,59. हमारी प्रयोगशाला ने प्रोटीन कार्यक्षमता पर लिपिड-प्रोटीन इंटरैक्शन के प्रभाव की जांच करने के लिए सरलीकृत जीयूवी दृष्टिकोण का उपयोग किया है, जो कि BODIPY-GTPπS को शामिल करके, जो रिसेप्टर की सक्रिय स्थिति में Giα सबयूनिट के साथ बांधता है। उनके बंधन एक प्रतिदीप्ति संकेत है कि समय के साथ पता लगाया जा सकता है का उत्पादन fluorophore unquanches. इसके अलावा, विभिन्न अध्ययनों ने लिपिड-प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच की और झिल्ली वक्रता 60,61 को संवेदन या स्थिर करने में प्रोटीन की भूमिका, और एक व्यवहार्य जीयूवी दृष्टिकोण का उपयोग करना एक महत्वपूर्ण लाभ हो सकता है।
यह प्रोटोकॉल एक संशोधित agarose हाइड्रोजेल system17,42 का उपयोग करके GUVs की झिल्ली में GPCRs को शामिल करने के लिए एक सरल विधि प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, हमारे पिछले काम के आधार पर, हमारी विधि आईएमपी के लिए उपयुक्त हो सकती है जो 30-40 डिग्री सेल्सियस तक अल्पकालिक जोखिम सहन कर सकती है। संक्षेप में, हम ब्याज के GPCR युक्त झिल्ली टुकड़े के साथ संयुक्त agarose की एक पतली फिल्म फैल. इस परत के जेलेशन के बाद, हम एगारोज़ के ऊपर एक लिपिड समाधान जमा करते हैं और विलायक को वाष्पित करने की अनुमति देते हैं। सिस्टम का पुनर्जलीकरण तब एक जलीय बफर के साथ किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप लिपिड बाईलेयर में शामिल प्रोटीन के साथ जीयूवी का गठन हुआ था।
हमने दो चरणों की पहचान की है जो समग्र प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं: प्लाज्मा उपचार और लिपिड जमाव। कवरस्लिप की प्लाज्मा सफाई यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि ग्लास कवरस्लिप के लिए एगार?…
The authors have nothing to disclose.
हम मूल्यवान चर्चा और सलाह के लिए मैथ्यू Blosser धन्यवाद. इस काम को नौसेना अनुसंधान कार्यालय (N00014-16-1-2382) और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (PHY-1915017) द्वारा समर्थित किया गया था।
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850375C-25mg | |
TI-Eclipse inverted microscope | Nikon, Melville, NY | Eclipse Ti | |
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850355C-25mg | |
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings | Sterling Seal & Supply, Neptune, IN | 5-003-8770 | |
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera | Photometrics, Huntington Beach, CA | Cascade II 512 | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850457C-25mg | |
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm | Coherent, Santa Clara, CA | 488/561-50-LS | |
5-HT1AR membrane fragments | Perkin Elmer, Waltham, MA | RBHS1AM400UA | |
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) | ATTO-TEC, Siegen, Germany | AD 488-155 | |
Bench top plasma cleaner | Harrick Plasma, Ithaca, NY | PDC-32G | |
bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A9418 | |
chloroform (CHCl3) | Millipore Sigma, Burlington, MA | CX1055 | |
Cholesterol (Chol) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | C8667-5G | |
Corning 96-well Flat Clear Bottom | Corning, Corning, NY | 3904 | |
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic | Elma, Singen, Germany | [no longer sold on main website] | |
glucose | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G7528 | |
methanol (MeOH) | Millipore Sigma, Burlington, MA | MX0485 | |
NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ND-1000 | |
NHS-Rhodamine | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 46406 | |
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) | Corning, Corning, NY | 21-040 | |
spinning-disc CSUX confocal head | Yokogawa,Tokyo, Japan | CSU-X1 | |
standard 25 mm no. 1 glass coverslips | ChemGlass, Vineland, NJ | CLS-1760 | |
sucrose | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S7903 | |
Sykes-Moore chambers | Bellco, Vineland, NJ | 1943-11111 | |
Ultra-low melting temperature agarose | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5030 | |
VWR Analog Heatblock | VWR International, Radnor, PA | [no longer sold on main website] | |
VWR Tube Rotator | VWR International, Radnor, PA | 10136-084 | |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 89882 |