Konstruktion av modell lipidmembran som innehåller G-protein kopplade receptorer (GPCR)

Summary

Detta protokoll använder agarose svullnad som en kraftfull och generaliserbar teknik för att införliva integrerade membranproteiner (IMPs) i jätte unilameller lipid vesicles (GUVs), som beskrivs här för rekonstitution av mänskliga 1A serotonin receptor protein (_5-HT1AR), en av klasserna av farmakologiskt viktiga G protein-kopplade receptorer.

Abstract

Robusta in vitro-undersökningar av strukturen och funktionen hos integrerade membranproteiner har varit en utmaning på grund av plasmamembranets komplexitet och de många faktorer som påverkar proteinbeteendet i levande celler. Giant unilamellar vesiklar (GUVs) är ett biomimetiskt och mycket tunable in vitro-modellsystem för att undersöka protein-membraninteraktioner och undersöka proteinbeteende på ett exakt, stimulansberoende sätt. I detta protokoll presenterar vi en billig och effektiv metod för att tillverka GUVs med den mänskliga serotonin 1A-receptorn (_5-HT1AR) stabilt integrerad i membranet. Vi tillverkar GUVs med en modifierad hydrogel svullnad metod; Genom att deponera en lipidfilm ovanpå en blandning av agaros och _5-HT1AR och sedan hydrera hela systemet, kan blåsor bildas med korrekt orienterad och funktionell 5-HT1AR införlivad i membranet. Dessa GUVs kan sedan användas för att undersöka protein-membran interaktioner och lokalisering beteende via mikroskopi. I slutändan kan detta protokoll öka vår förståelse av funktionaliteten hos integrerade membranproteiner, vilket ger djupgående fysiologisk insikt.

Introduction

Syntetiska modellmembran är kraftfulla verktyg i undersökningen av de grundläggande egenskaperna och funktionerna hos biomembraner. Giant unilamellar vesiklar (GUVs) är en av de mest framstående plattformarna för att studera en mängd olika plasmamembranegenskaper och kan konstrueras för att efterlikna olika fysiologiska förhållanden1,2,3,4,5,6,7,8. Det är välkänt att plasmamembranet och dess organisation spelar en nyckelroll i en mängd cellulära processer, såsom signaltransduktion, vidhäftning, endocytos och transport9,10,11,12,13,14,15.

GUVs har tillverkats med olika metoder, inklusive mild ^hydrering16, hydrogelsvullnad17, elektroformation18, mikrofluidiska tekniker19,20,21,22, ^jetting23 och lösningsmedelsutbyte24,25,26. På grund av utmaningar med att hantera integrerade membranproteiner (IMPs) har in vitro-plattformar för att studera dem begränsats. GUVs presenterar en förenklad plattform för att studera IMP: er i en miljö som efterliknar deras ursprungliga miljö. Även om det har funnits flera metoder för proteinrekonstitution i GUVs, uppstår utmaningar från att införliva proteiner med rätt orientering och upprätthålla protein ^{funktionalitet27}.

Den mest framgångsrika proteinrekonstitutionen i GUV kräver tvättmedelsutbytesmetoden. vilket innebär att proteinerna från deras ursprungliga miljö solubiliseras med tvättmedel, följt av proteinrening, och sedan ersätta tvättmedelsmolekylerna med lipider genom olika ^metoder28. Medan tvättmedel tjänar till att stabilisera den tertiära strukturen hos IMPs under rening, är tvättmedel micelles en relativt onaturlig miljö för dessa proteiner, som är bättre stabiliserade, särskilt för funktionella studier, i lipidbilayers28,29,30. Dessutom har det varit svårt att införliva funktionella transmembranproteiner i lipidbilayer med traditionella GUV-tillverkningstekniker på grund av dessa proteiners storlek, delikatess och de ytterligare åtgärder för utbyte av tvättmedel som skulle behövas27,31,32,33. Användningen av organiskt lösningsmedel för att avlägsna tvättmedel orsakar proteinaggregering och ^{denaturering34}. En förbättrad tvättmedelsmedierad metod har varit lovande, men försiktighet behövs för tvättmedelsborttagningssteget och optimering kan behövas för specifika ^{proteiner31,35}. Dessutom kan metoder som använder elektroformation begränsa valet av protein och kanske inte är lämpliga för alla lipidkompositioner speciellt laddade lipider31,36,37. En annan teknik som har använts är peptidinducerad fusion av stora unilamellerblåsor (LUVs) som innehåller önskat protein med GUVs, även om det befanns vara mödosamt och kan leda till införande av främmande molekyler-de fusogenic peptiderna33,38,39. Gigantiska plasmamembranblåsor (GPMVs), som härrör från levande celler, kan användas för att övervinna några av dessa problem, men de tillåter minimal kontroll av den resulterande lipid- och proteinsammansättningen14,40,41. Därför utgör integrationen av IMP i bilipidskiktet av GUVs med hjälp av vår modifierade agarose svullnad metod en tillförlitlig metod för att ytterligare undersöka dessa proteiner i membran miljön42,43,44,45.

Cellulär signalering och kommunikation involverar en familj av proteiner som kallas G-proteinkopplade receptorer (GPCR); GPCR är bland den största familjen av proteiner och är associerade med modulering humör, aptit, blodtryck, kardiovaskulär funktion, andning, och sömn bland många andra fysiologiska ^funktioner46. I denna studie använde vi human serotonin 1A-receptor (_5-HT1AR) som är en prototypisk medlem av GPCR-familjen. _5-HT1AR finns i centrala nervsystemet (CNS) och blodkärlen; det påverkar många funktioner som kardiovaskulära, gastrointestinala, endokrina funktioner, samt deltar i regleringen av ^humör47. Ett stort hinder för GPCR-forskning uppstår från deras komplexa amfifila struktur, och GUVs presenterar en lovande plattform för undersökning av olika egenskaper av intresse, allt från proteinfunktionalitet, lipid-proteininteraktioner och protein-proteininteraktioner. Olika metoder har använts för att studera lipid-proteininteraktioner såsom ytplasmonresonans (SPR)^48,49, nukleär magnetisk resonansspektroskopi (NMR)^50,51, proteinfettöverlägg (PLO) ^{analys51,52,53,54}, infödd masspektrometri55, isoterm titreringskaorimetri (ITC)^56,57 och liposom sedimenteringsanalys58,59. Vårt labb har använt den förenklade GUV-metoden för att undersöka effekten av lipid-proteininteraktioner på proteinfunktionalitet genom att inkapsla BODIPY-GTPγS, som binder till _{Giα-underenheten} i receptorns aktiva tillstånd. Deras bindning släcker fluoroforen som producerar en fluorescenssignal som kan detekteras över ^tid45. Dessutom undersökte olika studier lipid-proteininteraktioner och proteiners roll för att känna av eller stabilisera membrankrökning60,61, och att använda en genomförbar GUV-metod kan vara en viktig fördel.

Detta protokoll visar en enkel metod för att införliva GPCRs i membranet av GUVs med hjälp av ett modifierat agarose hydrogel ^system17,42. Dessutom, baserat på vårt tidigare arbete, kan vår metod vara lämplig för IMP som kan bära kortvarig exponering för 30-40 °C. Kortfattat sprider vi en tunn film av agaros i kombination med membranfragment som innehåller GPCR av intresse. Efter gelering av detta lager deponerar vi en lipidlösning ovanpå agaroset och låter lösningsmedlet avdunsta. Rehydrering av systemet utfördes sedan med en vattenbuffert, vilket resulterade i bildandet av GUVs med protein som ingår i lipidbilayer.

Protocol

1. Proteinmärkning Låt NHS-Rhodamine, 5-HT1A membranfragment och en 7 K MWCO spin desaltning kolonn att balansera vid rumstemperatur. Lös upp 1 mg NHS-rhodamin i 100 μL dimetylsulfoxid (DMSO). Tillsätt 5 μL 1 M natriumbikarbonatlösning för att öka pH-värdet på 5-HT1AR-lösningen till pH 8. Tillsätt 3,66 μL av NHS-rhodaminlösningen till 50 μL av 5-HT1AR-lösningen och pipetten försiktigt upp och ner i ett mikrocentrifugerör.OBS: …

Representative Results

Koncentrationen av protein mättes, och graden av märkning beräknades som molarförhållandet mellan färgämnet och proteinet till 1:1. Genom att undersöka GUVs med hjälp av konfokal mikroskopi, kunde vi bekräfta framgångsrik bildandet och protein integration av blåsor. Lipiderna var märkt med 0,4 mol% ATTO 488-DPPE, och proteinet var kovalent märkt via rhodamin NHS-ester modifiering av primära aminer. Figur 2a och figur 2b visar en proteininkorporera…

Discussion

Vi har identifierat två steg som är avgörande för framgången för det övergripande protokollet: plasmabehandling och lipiddeposition. Plasmarengöring av täcksliparna är avgörande för att säkerställa att det finns tillräcklig täckning och vidhäftning av agaroshydrogelen till glastäcket. Plasmarengöring åstadkommer två saker: för det första tar det bort spår av organiskt material från glasytan; För det andra aktiverar den täckytan, vilket möjliggör en ökning av vätbarheten eftersom glasytans h…

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850375C-25mg
TI-Eclipse inverted microscope	Nikon, Melville, NY	Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings	Sterling Seal & Supply, Neptune, IN	5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera	Photometrics, Huntington Beach, CA	Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm	Coherent, Santa Clara, CA	488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments	Perkin Elmer, Waltham, MA	RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)	ATTO-TEC, Siegen, Germany	AD 488-155
Bench top plasma cleaner	Harrick Plasma, Ithaca, NY	PDC-32G
bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A9418
chloroform (CHCl3)	Millipore Sigma, Burlington, MA	CX1055
Cholesterol (Chol)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom	Corning, Corning, NY	3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic	Elma, Singen, Germany	[no longer sold on main website]
glucose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	G7528
methanol (MeOH)	Millipore Sigma, Burlington, MA	MX0485
NanoDrop ND-1000	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	ND-1000
NHS-Rhodamine	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)	Corning, Corning, NY	21-040
spinning-disc CSUX confocal head	Yokogawa,Tokyo, Japan	CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips	ChemGlass, Vineland, NJ	CLS-1760
sucrose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	S7903
Sykes-Moore chambers	Bellco, Vineland, NJ	1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A5030
VWR Analog Heatblock	VWR International, Radnor, PA	[no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator	VWR International, Radnor, PA	10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	89882