JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생체공학

G-protein Bağlantılı Reseptörleri (GPCR) içeren Model Lipid Membranlarının yapımı

Published: February 05, 2022
doi:
10.3791/62830
, ,
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science,University of Southern California

Summary

Bu protokol, farmakolojik olarak önemli G proteini bağlantılı reseptör sınıflarından biri olan insan 1A serotonin reseptör proteininin (5-HT1AR) yeniden uzlaştırılması için burada açıklandığı gibi, integral membran proteinlerini (IMP’ler) dev unilamellar lipid veziküllerine (GUVs) dahil etmek için güçlü ve genelleştirilebilir bir teknik olarak agarose şişmesini kullanır.

Abstract

İntegral membran proteinlerinin yapısı ve işlevinin sağlam in vitro incelemeleri, plazma zarının karmaşıklığı ve canlı hücrelerde protein davranışını etkileyen çok sayıda faktör nedeniyle zor olmuştur. Dev unilamellar vesicles (GUVs), protein-membran etkileşimlerini araştırmak ve protein davranışını kesin, uyarana bağlı bir şekilde araştırmak için biyomimetik ve yüksek oranda tonlanabilir bir in vitro model sistemidir. Bu protokolde, membrana saplanmış insan serotonin 1A reseptörü (5-HT1AR) ile GUV’ların üretimi için ucuz ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Modifiye hidrojel şişme yöntemi kullanarak GUV’lar imal ediyoruz; agarose ve 5-HT1AR karışımının üzerine bir lipid filmi biriktirerek ve daha sonra tüm sistemi nemlendirerek, membran içine dahil edilmiş düzgün yönlendirilmiş ve fonksiyonel 5-HT1AR ile vezikliler oluşturulabilir. Bu GUV’lar daha sonra mikroskopi ile protein-membran etkileşimlerini ve lokalizasyon davranışını incelemek için kullanılabilir. Sonuç olarak, bu protokol, derin fizyolojik içgörü sağlayarak integral membran proteinlerinin işlevselliği hakkındaki anlayışımızı ilerletebilir.

Introduction

Sentetik model membranlar, biyomembranların temel özelliklerinin ve işlevlerinin araştırılmasında güçlü araçlardır. Dev unilamellar veziküller (GUV’ler) çeşitli plazma membran özelliklerini incelemek için en belirgin platformlardan biridir ve farklı fizyolojik durumları taklit etmek için tasarlanmış olabilir1,2,3,4,5,6,7,8. Plazma membranının ve organizasyonunun sinyal transdüksiyonu, yapışıklık, endositoz ve transport9,10,11,12,13,14,15 gibi çok sayıda hücresel işlemde kilit rol oynadığı iyi belirlenmiştir.

GUV’lar nazik hidrasyon16, hidrojel şişme17, elektroformasyon18, mikroakışkan teknikler19,20,21,22, jetting23 ve solvent değişimi24,25,26 dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak üretilmiştir. İntegral membran proteinlerinin (IMP) işlenmesindeki zorluklar nedeniyle, bunları incelemek için in vitro platformlar sınırlı olmuştur. GUV’ler, IMP’leri yerel ortamlarını taklit eden bir ortamda incelemek için basitleştirilmiş bir platform sunar. GUV’lerde protein rekonsesi için çeşitli yaklaşımlar olmasına rağmen, proteinlerin doğru oryantasyonla birleştirilmesi ve protein işlevselliğinin korunmasından kaynaklanan zorluklar ortaya çıkmaktadır27.

GUV’larda en başarılı protein rekonsesi deterjan değişim yöntemini gerektirir; proteinlerin deterjanlarla kendi çevrelerinden çözünür hale getirilmesini, ardından protein saflaştırılmasını ve daha sonra deterjan moleküllerinin çeşitli yöntemlerle lipitlerle değiştirilmesini içerir28. Deterjanlar saflaştırma sırasında IMP’lerin üçüncül yapısını stabilize etmeye hizmet ederken, deterjan miselleri lipid bilayers28,29,30’da özellikle fonksiyonel çalışmalar için daha iyi stabilize edilen bu proteinler için nispeten doğal olmayan bir ortamdır. Ayrıca, geleneksel GUV imalat teknikleri kullanılarak fonksiyonel transmembran proteinlerinin lipid bilayer içine dahil edilmesi, bu proteinlerin büyüklüğü, inceliği ve ihtiyaç duyulacak ek deterjan değişim adımları nedeniyle zor olmuştur27,31,32,33. Deterjanları çıkarmak için organik çözücü kullanımı protein toplama ve denatüre edilmesine neden olur34. Geliştirilmiş deterjan aracılı bir yöntem umut vericidir, ancak deterjan giderme adımı için dikkatli olunması ve belirli proteinler için optimizasyon gerekebilir31,35. Ek olarak, elektroformasyon kullanan yöntemler protein seçimini kısıtlayabilir ve özellikle yüklü lipitler için tüm lipit bileşimleri için uygun olmayabilir31,36,37. Kullanılan bir diğer teknik, istenen proteini içeren büyük unilameller vesicles’in (LUV) PEPTİD kaynaklı füzyonudur, ancak zahmetli olduğu ve yabancı moleküllerin yerleştirilmesine yol açabileceği bulunmuştur-fusojenik peptitler33,38,39. Canlı hücrelerden elde edilen dev plazma membran veziklikleri (GPMV’ler) bu sorunların bazılarının üstesinden gelmek için kullanılabilir, ancak ortaya çıkan lipit ve protein bileşiminin minimum kontrolüne izin verir14,40,41. Bu nedenle, modifiye agarose şişme yöntemimizi kullanarak IMP’lerin GUV’lerin bilipid tabakasına entegrasyonu, bu proteinleri membran ortamında daha fazla incelemek için güvenilir bir yöntem sürmektedir42,43,44,45.

Hücresel sinyalizasyon ve iletişim, G protein bağlantılı reseptörler (GPCR) olarak bilinen bir protein ailesini içerir; GPCR’ler en büyük protein ailesi arasındadır ve diğer birçok fizyolojik fonksiyon arasında ruh hali, iştah, kan basıncı, kardiyovasküler fonksiyon, solunum ve uyku modülasyonu ile ilişkilidir46. Bu çalışmada GPCR ailesinin prototipik bir üyesi olan insan serotonin 1A reseptörü (5-HT1AR) kullanıldı. 5-HT1AR merkezi sinir sistemi (CNS) ve kan damarlarında bulunabilir; kardiyovasküler, gastrointestinal, endokrin fonksiyonlar gibi çok sayıda işlevi etkiler ve mood47’nin düzenlenmesine katılır. GPCR araştırmalarının önündeki büyük bir engel karmaşık amfifilik yapılarından kaynaklanmaktadır ve GUV’lar protein işlevselliği, lipid-protein etkileşimleri ve protein-protein etkileşimleri gibi çeşitli ilgi çekici özelliklerin araştırılması için umut verici bir platform sunun. Yüzey plazmon rezonansı (SPR)48,49, nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR)50,51, protein lipid kaplaması (FKÖ) tahlil51,52,53,54, yerli kütle spektrometresi55, izotermal titrasyon kalorimetresi (ITC)56,57 ve lipozom sedimentasyon tahlil58,59. Laboratuvarımız, reseptörün aktif durumunda Giα alt birliğine bağlanan BODIPY-GTPφS’yi yalıtarak lipid-protein etkileşimlerinin protein işlevselliği üzerindeki etkisini araştırmak için basitleştirilmiş GUV yaklaşımını kullanmıştır. Bağlamaları, zaman içinde tespit edilebilen bir floresan sinyali üreten floroforu çözer45. Ayrıca, çeşitli çalışmalar Lipid-protein etkileşimlerini ve proteinlerin membran eğriliğini algılama veya stabilize etmedeki rolünü araştırdı60,61 ve uygulanabilir bir GUV yaklaşımı kullanmak önemli bir avantaj olabilir.

Bu protokol, modifiye edilmiş bir agarose hidrojel sistemi17,42 kullanarak GPCR’leri GUV’lerin membranına dahil etmek için basit bir yöntem göstermektedir. Ayrıca, önceki çalışmalarımıza dayanarak, yöntemimiz 30-40 ° C’ye kısa süreli maruz kalabilen IMP’ler için uygun olabilir. Kısaca, ilgi GPCR’sini içeren membran parçalarıyla birlikte ince bir agarose filmi yaydık. Bu tabakanın jelasyonunu takiben, agarose üzerine bir lipit çözeltisi biriktiriyoruz ve çözücüyün buharlaşmasını sağlıyoruz. Sistemin yeniden sulanması daha sonra sulu bir tampon ile gerçekleştirildi ve lipid bilayer’e dahil protein içeren GUV’lerin oluşumuna neden oldu.

Protocol

1. Protein etiketleme NHS-Rhodamine, 5-HT1A membran parçaları ve bir adet 7 K MWCO spin tuzdan arındırma kolonunun oda sıcaklığında dengede olmasını sağlar. 100 μL dimetil sülfit (DMSO) içinde 1 mg NHS-rhodamin çözün. pH 8’e 5-HT1AR çözeltisinin pH’ını artırmak için 5 μL 1 M sodyum bikarbonat çözeltisi ekleyin. 5-HT1AR çözeltisinin 50 μL’sine 3,66 μL NHS-rhodamin çözeltisi ekleyin ve pipet bir mikrosantrifüj tüpünd…

Representative Results

Protein konsantrasyonu ölçüldü ve etiketleme derecesi boya ile protein arasındaki azı dişi oranı olarak 1:1 olarak hesaplandı. Konfokal mikroskopi kullanarak GUV’ları inceleyerek veziklin başarılı oluşumunu ve protein entegrasyonunu doğrulayabildik. Lipitler %0.4 atto 488-DPPE ile etiketlendi ve protein rhodamine NHS-ester birincil aminlerin modifikasyonu ile birlikte etiketlendi. Şekil 2a ve Şekil 2b sırasıyla ATTO 488 ve rhodamin kanalların…

Discussion

Genel protokolün başarısı için kritik olan iki adım belirledik: plazma tedavisi ve lipid birikimi. Kapak kapaklarının plazma temizliği, agarose hidrojelinin cam kapak kapağına yeterli kapsama alanı ve yapıştırılmasının sağlanmasında esastır. Plazma temizliği iki şeyi gerçekleştirir: birincisi, cam yüzeyinden organik madde izlerini temizler; ikinci olarak, kapak yüzeyini aktive eder, cam yüzey hidrofilizliği arttıkça ıslanabilirlikte bir artış sağlar62,63</su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Matthew Blosser’a değerli tartışmalar ve tavsiyeler için teşekkür ederiz. Bu çalışma Deniz Araştırmaları Ofisi (N00014-16-1-2382) ve Ulusal Bilim Vakfı (PHY-1915017) tarafından desteklendi.

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850375C-25mg
 TI-Eclipse inverted microscope Nikon, Melville, NY Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings Sterling Seal & Supply, Neptune, IN 5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera Photometrics, Huntington Beach, CA  Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm Coherent, Santa Clara, CA 488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments Perkin Elmer, Waltham, MA RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) ATTO-TEC, Siegen, Germany AD 488-155
Bench top plasma cleaner Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-32G
bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich, St. Louis, MO A9418
chloroform (CHCl3) Millipore Sigma, Burlington, MA CX1055
Cholesterol (Chol) Sigma Aldrich, St. Louis, MO C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom Corning, Corning, NY 3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic Elma, Singen, Germany [no longer sold on main website]
glucose Sigma Aldrich, St. Louis, MO G7528
methanol (MeOH) Millipore Sigma, Burlington, MA MX0485
NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ND-1000
NHS-Rhodamine Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) Corning, Corning, NY 21-040
spinning-disc CSUX confocal head Yokogawa,Tokyo, Japan CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips ChemGlass, Vineland, NJ CLS-1760
sucrose Sigma Aldrich, St. Louis, MO S7903
Sykes-Moore chambers Bellco, Vineland, NJ 1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5030
VWR Analog Heatblock VWR International, Radnor, PA [no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator VWR International, Radnor, PA 10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 89882
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9, 467-508 (1980).
  2. Mouritsen, O. G. Model answers to lipid membrane questions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), 004622 (2011).
  3. Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  4. Li, S., Hu, P., Malmstadt, N. Confocal imaging to quantify passive transport across biomimetic lipid membranes. Analytical Chemistry. 82 (18), 7766-7771 (2010).
  5. Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2010).
  6. Elbaradei, A., Brown, S. L., Miller, J. B., May, S., Hobbie, E. K. Interaction of polymer-coated silicon nanocrystals with lipid bilayers and surfactant interfaces. Physical Review E. 94 (4), 042804 (2016).
  7. Veatch, S. L., Keller, S. L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Physical Review Letters. 89 (26), 268101 (2002).
  8. Plasencia, I., Norlén, L., Bagatolli, L. A. Direct visualization of lipid domains in human skin stratum corneum’s lipid membranes: Effect of pH and temperature. Biophysical Journal. 93 (9), 3142-3155 (2007).
  9. Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophysical Journal. 80 (3), 1417-1428 (2001).
  10. Deans, J. P., Li, H., Polyak, M. J. CD20-mediated apoptosis: signalling through lipid rafts. Immunology. 107 (2), 176-182 (2002).
  11. Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 32, 257-283 (2003).
  12. Pike, L. J. Lipid rafts: bringing order to chaos. Journal of Lipid Research. 44 (4), 655-667 (2003).
  13. Tsui-Pierchala, B. A., Encinas, M., Milbrandt, J., Johnson, E. M. Lipid rafts in neuronal signaling and function. Trends in Neurosciences. 25 (8), 412-417 (2002).
  14. Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
  15. Scheve, C. S., Gonzales, P. A., Momin, N., Stachowiak, J. C. Steric pressure between membrane-bound proteins opposes lipid phase separation. Journal of the American Chemical Society. 135 (4), 1185-1188 (2013).
  16. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  17. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of agarose enable rapid formation of giant liposomes in solutions of physiologic ionic strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  18. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  19. Teh, S. -. Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), (2011).
  20. Hu, P. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic fabrication of asymmetric giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (5), 1434-1440 (2011).
  21. Lu, L., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Continuous microfluidic fabrication of synthetic asymmetric vesicles. Lab on a Chip. 15 (17), 3591-3599 (2015).
  22. Maktabi, S., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Dewetting-induced formation and mechanical properties of synthetic bacterial outer membrane models (GUVs) with controlled inner-leaflet lipid composition. Soft Matter. 15 (19), 3938-3948 (2019).
  23. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  24. Kim, S., Martin, G. M. Preparation of cell-size unilamellar liposomes with high captured volume and defined size distribution. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 646 (1), 1-9 (1981).
  25. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  26. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. le Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  29. Rigaud, J. -. L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods in Enzymology. 372, 65-86 (2003).
  30. Renthal, R. An unfolding story of helical transmembrane proteins. 생화학. 45 (49), 14559-14566 (2006).
  31. Jørgensen, I. L., Kemmer, G. C., Pomorski, T. G. Membrane protein reconstitution into giant unilamellar vesicles: a review on current techniques. European Biophysics Journal. 46 (2), 103-119 (2017).
  32. Hansen, J. S., et al. Formation of giant protein vesicles by a lipid cosolvent method. ChemBioChem. 12 (18), 2856-2862 (2011).
  33. Kahya, N., Pécheur, E. -. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
  34. Kahya, N., Merkle, D., Schwille, P. Pushing the complexity of model bilayers: Novel prospects for membrane biophysics. Fluorescence of Supermolecules, Polymers, and Nanosystems. , 339-359 (2008).
  35. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Lévy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  36. Shaklee, P. M., et al. Protein incorporation in giant lipid vesicles under physiological conditions. ChemBioChem. 11 (2), 175-179 (2010).
  37. Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1712 (2), 152-160 (2005).
  38. Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 87 (1), 419-429 (2004).
  39. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  40. Levental, I., et al. Cholesterol-dependent phase separation in cell-derived giant plasma-membrane vesicles. The Biochemical Journal. 424 (2), 163-167 (2009).
  41. López-Montero, I., Rodríguez-García, R., Monroy, F. Artificial spectrin shells reconstituted on giant vesicles. The Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (12), 1583-1588 (2012).
  42. Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. Journal of the American Chemical Society. 135 (46), 17294-17297 (2013).
  43. Gutierrez, M. G., Malmstadt, N. Human serotonin receptor 5-HT 1A preferentially segregates to the liquid disordered phase in synthetic lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13530-13533 (2014).
  44. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  45. Gutierrez, M. G., Mansfield, K. S., Malmstadt, N. The functional activity of the human serotonin 5-HT 1A receptor is controlled by lipid bilayer composition. Biophysical Journal. 110, 2486-2495 (2016).
  46. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
  47. Nichols, D. E., Nichols, C. D. Serotonin receptors. Chemical Reviews. 108 (5), 1614-1641 (2008).
  48. Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using surface plasmon resonance to quantitatively assess lipid-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1376, 141-153 (2016).
  49. Place, J. F., Sutherland, R. M., Dähne, C. Opto-electronic immunosensors: a review of optical immunoassay at continuous surfaces. Biosensors. 1 (4), 321-353 (1985).
  50. Brown, M. F., Miljanich, G. P., Franklin, L. K., Dratz, E. A. H-NMR studies of protein-lipid interactions in retinal rod outer segment disc membranes. FEBS letters. 70 (1), 56-60 (1976).
  51. Sun, F., et al. Structural basis for interactions of the Phytophthora sojae RxLR effector Avh5 with phosphatidylinositol 3-phosphate and for host cell entry. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (3), 330-344 (2013).
  52. Kavran, J. M., et al. Specificity and promiscuity in phosphoinositide binding by pleckstrin homology domains. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30497-30508 (1998).
  53. Stevenson, J. M., Perera, I. Y., Boss, W. F. A phosphatidylinositol 4-Kinase pleckstrin homology domain that binds phosphatidylinositol 4-Monophosphate. Journal of Biological Chemistry. 273 (35), 22761-22767 (1998).
  54. Han, X., Yang, Y., Zhao, F., Zhang, T., Yu, X. An improved protein lipid overlay assay for studying lipid-protein interactions. Plant Methods. 16 (1), 33 (2020).
  55. Yen, H. -. Y., et al. PtdIns(4,5)P 2 stabilizes active states of GPCRs and enhances selectivity of G-protein coupling. Nature. 559 (7714), 423-427 (2018).
  56. Myers, M., Mayorga, O. L., Emtage, J., Freire, E. Thermodynamic characterization of interactions between ornithine transcarbamylase leader peptide and phospholipid bilayer membranes. 생화학. 26 (14), 4309-4315 (1987).
  57. Swamy, M. J., Sankhala, R. S. Probing the thermodynamics of protein-lipid interactions by isothermal titration calorimetry. Lipid-Protein Interactions: Methods and Protocols. , 37-53 (2013).
  58. Han, X., Shi, Y., Liu, G., Guo, Y., Yang, Y. Activation of ROP6 GTPase by phosphatidylglycerol in arabidopsis. Frontiers in Plant Science. , (2018).
  59. Surolia, A., Bachhawat, B. K. The effect of lipid composition on liposome-lectin interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 83 (3), 779-785 (1978).
  60. Sarkis, J., Vié, V. Biomimetic models to investigate membrane biophysics affecting lipid-protein interaction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 270 (2020).
  61. McMahon, H. T., Boucrot, E. Membrane curvature at a glance. Journal of Cell Science. 128 (6), 1065-1070 (2015).
  62. Banerjee, K. K., Kumar, S., Bremmell, K. E., Griesser, H. J. Molecular-level removal of proteinaceous contamination from model surfaces and biomedical device materials by air plasma treatment. Journal of Hospital Infection. 76 (3), 234-242 (2010).
  63. Raiber, K., Terfort, A., Benndorf, C., Krings, N., Strehblow, H. -. H. Removal of self-assembled monolayers of alkanethiolates on gold by plasma cleaning. Surface Science. 595 (1), 56-63 (2005).
  64. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A 2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  65. Garten, M., Levy, D., Bassereau, P. The giant vesicle book. The giant vesicle book. , 38-51 (2021).
  66. Gutierrez, M. G., et al. G Protein-coupled receptors incorporated into rehydrated diblock copolymer vesicles retain functionality. Small. 12 (38), 5256-5260 (2016).
  67. Peruzzi, J., Gutierrez, M. G., Mansfield, K., Malmstadt, N. Dynamics of hydrogel-assisted giant unilamellar vesicle formation from unsaturated lipid systems. Langmuir. 32 (48), 12702-12709 (2016).
  68. Shchelokovskyy, P., Tristram-Nagle, S., Dimova, R. Effect of the HIV-1 fusion peptide on the mechanical properties and leaflet coupling of lipid bilayers. New Journal of Physics. 13, 025004 (2011).

Tags

GUVsGiant Unilamellar VesiclesMembrane ProteinsGPCRsG Protein-coupled Receptors5-HT1ARSerotonin ReceptorHydrogel ScaffoldLipid MembraneProtein IncorporationBiomimetic ModelIn Vitro Studies
check_url/kr/62830?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C., Malmstadt, N. Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs). J. Vis. Exp. (180), e62830, doi:10.3791/62830 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image