用户友好型、高通量和全自动数据采集软件，用于单颗粒冷冻电子显微镜
Summary
单颗粒冷冻电子显微镜需要合适的软件包和用户友好的管道来实现高通量自动数据采集。在这里，我们介绍了全自动图像采集软件包Latitude-S的应用，以及用于在低剂量条件下收集玻化生物分子数据的实用管道。
Abstract
近年来，单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）的技术和方法学进步为生物大分子的高分辨率结构测定铺平了新的途径。尽管冷冻电镜取得了显著进展，但在单颗粒分析工作流程的各个方面仍有改进的余地。单颗粒分析需要合适的软件包来实现高通量自动数据采集。在过去八年中，开发了几个自动数据采集软件包，用于单颗粒冷冻电镜的自动成像。本文提出了一种全自动图像采集管线在低剂量条件下用于玻化生物分子的应用。
它演示了一个软件包，可以完全、自动、精确地收集冷冻电镜数据。此外，该软件包可以轻松控制各种微观参数。该协议证明了该软件包在配备直接电子探测器（DED）的200 keV冷冻电子显微镜对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）刺突蛋白进行自动成像方面的潜力。在单次（48小时）的数据收集中采集了大约3，000张冷冻电镜电影图像，产生了SARS-CoV-2刺突蛋白的原子分辨率结构。此外，该结构研究表明，刺突蛋白采用两种主要构象，1-RBD（受体结合结构域）向上开放，所有RBD向下闭合构象。
Introduction
单颗粒冷冻电镜已成为生物大分子高分辨率结构测定的主流结构生物学技术1。单颗粒重建依赖于获取大量玻化样品的显微照片来提取二维（2D）颗粒图像，然后用于重建生物大分子的三维（3D）结构2，3。在DED开发之前，单粒子重建获得的分辨率在4到30 Å4，5之间。最近，单颗粒冷冻电镜可实现的分辨率已超过1.8 Å6。DED和自动数据采集软件是这一分辨率革命7的主要贡献者，其中人为数据收集干预最少。通常，冷冻电镜成像以低电子剂量率（20-100 e / Å2）进行，以最大限度地减少电子束引起的生物样品辐射损伤，这有助于图像中的低信噪比（SNR）。这种低SNR阻碍了使用单颗粒分析表征生物大分子的高分辨率结构。
新一代电子探测器是基于CMOS（互补金属氧化物半导体）的探测器，可以克服这些与SNR相关的低障碍。这些直接检测CMOS相机可以快速读出信号，因此相机为生物大分子提供了更好的点扩散功能，合适的SNR和出色的检测量子效率（DQE）。直接检测相机在记录的图像中提供高SNR8 和低噪声，从而定量提高检测量子效率（DQE） – 测量探测器向图像增加的噪声量。这些相机还以每秒数百帧的速度录制短片，从而实现快速数据采集9，10。所有这些特性使得快速直接检测相机适用于低剂量应用。
运动校正堆栈图像用于数据处理，以计算2D分类，并使用各种软件包（如RELINE11，FREALIGN12，cryoSPARC13，cisTEM14和EMAN215）重建大分子的3D密度图。然而，对于单粒子分析，需要一个巨大的数据集来实现高分辨率结构。因此，自动数据采集收费对于数据收集至关重要。为了记录大型冷冻电镜数据集，在过去十年中已经使用了几个软件包。专用软件包，如AutoEM16，AutoEMation17，Leginon18，SerialEM19，UCSF-Image420，TOM221，SAM22，JAMES23，JADAS24，EM-TOOLS和EPU，已经开发用于自动数据采集。
这些软件包使用常规任务，通过将低倍率图像与高倍率图像相关联来自动查找孔位置，这有助于识别具有专有冰厚的玻璃体冰的孔，以便在低剂量条件下进行图像采集。这些软件包通过连续几天获取大量高质量数据，减少了重复性任务的数量，并提高了冷冻电镜数据收集的吞吐量，没有任何中断和操作员的物理存在。Latitude-S是一个类似的软件包，用于单颗粒分析的自动数据采集。但是，该软件包仅适用于K2 / K3 DED，并随这些探测器一起提供。
该协议证明了Latitude-S在使用配备200 keV冷冻电镜的直接电子探测器自动图像采集SARS-CoV-2刺突蛋白方面的潜力（见 材料表）。利用该数据采集工具，自动采集3000个SARS-CoV-2刺突蛋白电影文件，并进行进一步的数据处理，得到分辨率为3.9-4.4Å的刺突蛋白结构。
Protocol
Representative Results
Discussion
Latitude-S 是一个直观的用户界面，它提供了一个环境，可以在两天内自动设置和收集数千张高分辨率显微照片或电影文件。它提供了跨网格的轻松导航，并在显微镜载物台从低放大倍率移动到高放大倍率时保持显微镜载物台的位置。使用Latitude-S进行数据采集的每个步骤都非常省时，具有简单的用户界面，以高达4.5 GB / s的速度快速流式传输数据以及在采集过程中同时显示数据等功能。此外，预校准…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢印度生物技术部，科学技术部（DST）和科学部以及人力资源开发部（MHRD）提供资金和IISc-Bangalore的冷冻电镜设施。我们感谢位于班加罗尔IISc的国家冷冻电镜设施的DBT-BUILDER计划（BT / INF / 22 / SP22844 / 2017）和DST-FIST（SR / FST / LSII-039 / 2015）。我们感谢科学与工程研究委员会（SERB）（拨款编号-SB/S2/RJN-145/2015、SERB-EMR/2016/000608和SERB-IPA/2020/000094）、DBT（拨款编号：SERB）的财政支持。BT/PR25580/BRB/10/1619/2017）。我们感谢Ishika Pramanick女士准备冷冻电镜网格，冷冻电镜数据收集和准备 材料表。我们还感谢Suman Mishra先生的冷冻电镜图像处理，并帮助我们准备数字。我们感谢Raghavan Varadarajan教授帮助我们为这项研究获得纯化的刺突蛋白样品。
Materials
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
References
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