Software di acquisizione dati intuitivo, ad alta produttività e completamente automatizzato per microscopia crioelettronica a particella singola
Summary
La microscopia crioelettronica a singola particella richiede un pacchetto software adatto e una pipeline user-friendly per l’acquisizione automatica dei dati ad alto rendimento. Qui presentiamo l’applicazione di un pacchetto software di acquisizione di immagini completamente automatizzato, Latitude-S, e una pratica pipeline per la raccolta di dati di biomolecole vetrificate in condizioni a basso dosaggio.
Abstract
Negli ultimi anni, i progressi tecnologici e metodologici nella microscopia crioelettronica a singola particella (cryo-EM) hanno aperto una nuova strada per la determinazione della struttura ad alta risoluzione delle macromolecole biologiche. Nonostante i notevoli progressi nella crio-EM, c’è ancora spazio per miglioramenti in vari aspetti del flusso di lavoro di analisi delle singole particelle. L’analisi a singola particella richiede un pacchetto software adatto per l’acquisizione automatica dei dati ad alta produttività. Negli ultimi otto anni sono stati sviluppati diversi pacchetti software di acquisizione automatica dei dati per l’imaging automatico per la crio-EM a singola particella. Questo documento presenta un’applicazione di una pipeline di acquisizione di immagini completamente automatizzata per biomolecole vetrificate in condizioni a basso dosaggio.
Dimostra un pacchetto software in grado di raccogliere dati crio-EM in modo completo, automatico e preciso. Inoltre, vari parametri microscopici sono facilmente controllabili da questo pacchetto software. Questo protocollo dimostra il potenziale di questo pacchetto software nell’imaging automatizzato della proteina spike della sindrome respiratoria acuta grave-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) con un microscopio crioelettronico da 200 keV dotato di un rilevatore di elettroni diretti (DED). Circa 3.000 immagini di film crio-EM sono state acquisite in una singola sessione (48 ore) di raccolta dati, producendo una struttura a risoluzione atomica della proteina spike di SARS-CoV-2. Inoltre, questo studio strutturale indica che la proteina spike adotta due conformazioni principali, 1-RBD (dominio di legame del recettore) in alto aperto e tutte le conformazioni RBD giù chiuse.
Introduction
La crio-EM a singola particella è diventata una tecnica di biologia strutturale tradizionale per la determinazione della struttura ad alta risoluzione delle macromolecole biologiche1. La ricostruzione di singole particelle dipende dall’acquisizione di un vasto numero di micrografie di campioni vetrificati per estrarre immagini di particelle bidimensionali (2D), che vengono poi utilizzate per ricostruire una struttura tridimensionale (3D) di una macromolecola biologica2,3. Prima dello sviluppo dei DED, la risoluzione ottenuta dalla ricostruzione di singole particelle variava tra 4 e 30 Å4,5. Recentemente, la risoluzione raggiungibile dalla crio-EM a singola particella ha raggiunto oltre 1,8 Å6. Il DED e il software di acquisizione dati automatizzato hanno contribuito in modo determinante a questa rivoluzione della risoluzione7, in cui l’intervento umano per la raccolta dei dati è minimo. Generalmente, l’imaging crio-EM viene eseguito a basse dosi di elettroni (20-100 e / Å2) per ridurre al minimo il danno da radiazioni indotto dal fascio di elettroni dei campioni biologici, che contribuisce al basso rapporto segnale-rumore (SNR) nell’immagine. Questo basso SNR impedisce la caratterizzazione delle strutture ad alta risoluzione delle macromolecole biologiche utilizzando l’analisi a singola particella.
I rivelatori di elettroni di nuova generazione sono rivelatori basati su CMOS (complementare metallo-ossido-semiconduttore), che possono superare questi ostacoli legati al basso SNR. Queste telecamere CMOS a rilevamento diretto consentono una lettura rapida del segnale, grazie alla quale la telecamera contribuisce a una migliore funzione di diffusione del punto, un SNR adatto e un’eccellente efficienza quantistica detective (DQE) per macromolecole biologiche. Le telecamere a rilevamento diretto offrono un elevato SNR8 e un basso rumore nelle immagini registrate, con conseguente aumento quantitativo dell’efficienza quantistica del detective (DQE), una misura della quantità di rumore che un rilevatore aggiunge a un’immagine. Queste telecamere registrano anche filmati alla velocità di centinaia di fotogrammi al secondo, il che consente una rapida acquisizione dei dati9,10. Tutte queste caratteristiche rendono le telecamere a rilevamento diretto rapido adatte per applicazioni a basso dosaggio.
Le immagini stack con correzione del movimento vengono utilizzate per l’elaborazione dei dati per calcolare la classificazione 2D e ricostruire una mappa di densità 3D delle macromolecole utilizzando vari pacchetti software come RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 e EMAN215. Tuttavia, per l’analisi a singola particella, è necessario un enorme set di dati per ottenere una struttura ad alta risoluzione. Pertanto, i pedaggi di acquisizione automatica dei dati sono estremamente essenziali per la raccolta dei dati. Per registrare grandi set di dati crio-EM, negli ultimi dieci anni sono stati utilizzati diversi pacchetti software. Pacchetti software dedicati, come AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS ed EPU, sono stati sviluppati per l’acquisizione automatica dei dati.
Questi pacchetti software utilizzano attività di routine per trovare automaticamente le posizioni dei fori correlando le immagini a basso ingrandimento alle immagini ad alto ingrandimento, che aiutano a identificare i fori con ghiaccio vitreo di spessore di ghiaccio appropriato per l’acquisizione di immagini in condizioni a basso dosaggio. Questi pacchetti software hanno ridotto il numero di attività ripetitive e aumentato il throughput della raccolta dati crio-EM acquisendo una grande quantità di dati di buona qualità per diversi giorni in modo continuo, senza alcuna interruzione e la presenza fisica dell’operatore. Latitude-S è un pacchetto software simile, che viene utilizzato per l’acquisizione automatica dei dati per l’analisi di singole particelle. Tuttavia, questo pacchetto software è adatto solo per ID K2 / K3 e viene fornito con questi rilevatori.
Questo protocollo dimostra il potenziale di Latitude-S nell’acquisizione automatica di immagini della proteina spike SARS-CoV-2 con un rivelatore di elettroni diretto dotato di un crio-EM da 200 keV (vedi la Tabella dei materiali). Utilizzando questo strumento di raccolta dati, 3.000 file di filmati della proteina spike SARS-CoV-2 vengono acquisiti automaticamente e viene effettuata un’ulteriore elaborazione dei dati per ottenere una struttura proteica spike con risoluzione 3,9-4,4 Å.
Protocol
Representative Results
Discussion
Latitude-S è un’interfaccia utente intuitiva, che fornisce un ambiente per configurare e raccogliere automaticamente migliaia di micrografie ad alta risoluzione o file di filmati in due giorni. Fornisce una facile navigazione attraverso le griglie e mantiene la posizione dello stadio del microscopio mentre passa da un basso ingrandimento ad un ingrandimento elevato. Ogni fase dell’acquisizione dei dati con Latitude-S è efficiente in termini di tempo, con funzionalità come una semplice interfaccia utente, uno streaming…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo il Dipartimento di Biotecnologia, il Dipartimento di Scienza e Tecnologia (DST) e Scienza, e il Ministero dello Sviluppo delle Risorse Umane (MHRD), India, per i finanziamenti e la struttura crio-EM di IISc-Bangalore. Riconosciamo il programma DBT-BUILDER (BT/INF/22/SP22844/2017) e DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) per la struttura National Cryo-EM di IISc, Bangalore. Riconosciamo il sostegno finanziario del Science and Engineering Research Board (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 e SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Ringraziamo la signora Ishika Pramanick per aver preparato le griglie crio-EM, la raccolta dei dati crio-EM e la preparazione della Tabella dei materiali. Ringraziamo anche il signor Suman Mishra per l’elaborazione delle immagini crio-EM e per averci aiutato a preparare le figure. Ringraziamo il Prof. Raghavan Varadarajan per averci aiutato a ottenere il campione di proteina spike purificato per questo studio.
Materials
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
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