単粒子クライオ電子顕微鏡用のユーザーフレンドリー、ハイスループット、および完全自動データ収集ソフトウェア
Summary
単粒子のクライオ電子顕微鏡では、高スループットの自動データ取得に適したソフトウェアパッケージとユーザーフレンドリーなパイプラインが必要です。ここでは、完全に自動化された画像取得ソフトウェアパッケージLatitude-Sの応用と、低線量条件下でのガラス化生体分子のデータ収集のための実用的なパイプラインを紹介する。
Abstract
過去数年間、単粒子クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)の技術と方法論的進歩は、生物学的高分子の高解像度構造決定のための新しい道を開きました。クライオEMの著しい進歩にもかかわらず、単粒子分析ワークフローの様々な側面において改善の余地が依然として存在する。単粒子分析では、高スループットの自動データ取得に適したソフトウェアパッケージが必要です。過去8年間に単粒子クライオEM用の自動イメージング用に、いくつかの自動データ取得ソフトウェアパッケージが開発されました。本論文は、低用量条件下でのガラス化生体分子に対する完全自動画像取得パイプラインの適用を提示する。
これは、cryo-EMデータを完全、自動的、および正確に収集できるソフトウェアパッケージを示しています。さらに、さまざまな顕微鏡パラメータは、このソフトウェアパッケージによって容易に制御されます。このプロトコルは、直接電子検出器(DED)を搭載した200 keVクライオ電子顕微鏡を用いた重症急性呼吸器症候群-コロナウイルス2(SARS-CoV-2)スパイクタンパク質の自動イメージングにおけるこのソフトウェアパッケージの可能性を示しています。1回のセッション(48時間)で約3,000枚のクライオEMムービー画像を取得し、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質の原子分解能構造を生み出しました。さらに、この構造研究は、スパイクタンパク質が開いた1-RBD(受容体結合ドメイン)およびすべてのRBD閉鎖された立体構造の2つの主要な立体構造を採用することを示している。
Introduction
単粒子クライオEMは、生体高分子の高分解能構造決定のための主流の構造生物学技術となっています1。単粒子の再構築は、2次元(2D)粒子画像を抽出するために膨大な数のガラス化サンプルの顕微鏡写真を取得することに依存し、その後、生物学的高分子の3次元(3D)構造を再構築するために使用されます。DEDの開発前に、単粒子の再構成から達成された分解能は4から30Å4,5の範囲に及んだ。最近、単粒子クライオEMからの達成可能な解像度は1.8 Å6を超えています。DEDおよび自動データ収集ソフトウェアは、データ収集のための人間の介入が最小限に抑えられるこの解決革命7の主要な貢献者となっています。一般に、クライオEMイメージングは、低電子線量率(20-100 e/Å2)で行われ、生体試料の電子ビームによる放射線損傷を最小限に抑え、画像内の低信号対雑音比(SNR)に寄与します。この低いSNRは、単粒子分析を用いた生体高分子の高分解能構造の特性解析を妨げる。
新世代の電子検出器は、CMOS(相補的な金属酸化物半導体)ベースの検出器で、これらの低いSNR関連の障害を克服することができます。これらの直接検出CMOSカメラは、カメラが優れた点広がり機能、適切なSNR、および生体高分子のための優れた探偵量子効率(DQE)に寄与するため、信号の高速読み出しを可能にします。直接検出カメラは、記録された画像に高いSNR8と低ノイズを提供し、その結果、検出器が画像にどれだけのノイズを追加するかを測定する探偵量子効率(DQE)の定量的な増加をもたらします。これらのカメラは毎秒数百フレームの速度で映画を録画し、高速データ取得を可能にします 9,10.これらの特性はすべて、低線量のアプリケーションに適した高速直接検出カメラを作ります。
動補正スタック画像は、RELION11、FREALIGN12、cryoSPARC13、cisTEM14、EMAN215などの様々なソフトウェアパッケージを使用して、2D分類を計算し、高分子の3D密度マップを再構築するためにデータ処理に使用されます。ただし、単一粒子解析では、高解像度の構造を実現するためには膨大なデータセットが必要です。したがって、自動データ取得の通行料は、データ収集に非常に重要です。大規模なクライオEMデータセットを記録するために、過去10年間にいくつかのソフトウェアパッケージが使用されてきました。AutoEM16、AutoEMation17、Leginon18、SerialEM19、UCSF-Image420、TOM221、SAM22、JAMES23、JADAS24、EM-TOOLS、EPUなどの専用ソフトウェアパッケージが自動データ取得用に開発されています。
これらのソフトウェアパッケージは、低倍率画像を高倍率画像に相関させることによって、自動的に穴位置を見つけるためにルーチンタスクを使用し、低線量条件下で画像取得のための割り当て氷の硝子体氷で穴を識別するのに役立ちます。これらのソフトウェアパッケージは、繰り返しのタスクの数を減らし、オペレータの物理的な存在を中断することなく、数日間連続して高品質のデータの膨大な量を取得することにより、クライオEMデータ収集のスループットを向上させます。Latitude-S は、単一粒子分析のための自動データ収集に使用される同様のソフトウェア パッケージです。しかし、このソフトウェアパッケージはK2/K3 DEDsにのみ適しており、これらの検出器を備えています。
このプロトコルは、200 keV cryo-EMを搭載した直接電子検出器を備えたSARS-CoV-2スパイクタンパク質の自動画像取得におけるLatitude-Sの可能性を示しています( 材料表を参照)。このデータ収集ツールを使用して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の3,000のムービーファイルが自動的に取得され、さらにデータ処理が行われ、3.9-4.4Å分解能スパイクタンパク質構造を得ます。
Protocol
Representative Results
Discussion
Latitude-S は直感的なユーザー インターフェイスで、2 日間で何千もの高解像度の顕微鏡写真やムービー ファイルを自動的にセットアップして収集する環境を提供します。それは格子を渡る容易な運行を提供し、顕微鏡段階の位置を維持し、低倍率から高倍率に移動する。Latitude-S によるデータ取得の各ステップは、シンプルなユーザー インターフェイス、最大 4.5 GB/秒の速度での高速データ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、バイオテクノロジー省、科学技術省(DST)、インドの人事開発省(MHRD)に対し、IISc-バンガロールの資金調達とクライオEM施設について認める。我々は、バンガロール州IIScのナショナルクライオEM施設に対するDBT-BUILDERプログラム(BT/INF/22/SP22844/2017)とDST-FIST(SR/FST/LSII-039/2015)を認めます。我々は、理工学研究委員会(SERB)(グラントNo.SB/S2/RJN-145/2015、SERB-EMR/2016/000608およびSERB-IPA/2020/000094)、DBT(グラントNo.1)からの財政支援を認める。BT/PR25580/BRB/10/1619/2017)。クライオEMグリッド、クライオEMデータ収集、 材料表の準備をしてくれたイシカ・プラマニックさんに感謝します。また、スマン・ミシュラ氏のクライオEM画像処理と、フィギュアの準備を手伝ってくれたことに感謝します。ラガヴァン・バラダラジャン教授は、この研究のために精製スパイクタンパク質サンプルを入手するのを助けてくれたことに感謝します。
Materials
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
References
- Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
- Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
- Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
- Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
- Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
- McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
- Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
- Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
- Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
- Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy – TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
- Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
- Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, 384-389 (2007).
- Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
- Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
- Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
- Hillen, H. S., et al. Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase. Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).
- Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
- Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
- Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).
