Software de aquisição de dados totalmente automatizado para microscopia crio-elétron de partículas únicas
Summary
A microscopia crio-elétron de partículas únicas exige um pacote de software adequado e um pipeline fácil de usar para aquisição automática de dados de alto rendimento. Aqui, apresentamos a aplicação de um pacote de software de aquisição de imagens totalmente automatizado, o Latitude-S, e um pipeline prático para coleta de dados de biomoléculas vitrificadas em condições de baixa dose.
Abstract
Nos últimos anos, avanços tecnológicos e metodológicos na microscopia crio-elétron de partículas únicas (crio-EM) abriram um novo caminho para a determinação da estrutura de alta resolução de macromoléculas biológicas. Apesar dos avanços notáveis no crio-EM, ainda há espaço para melhorias em vários aspectos do fluxo de trabalho de análise de partículas únicas. A análise de partículas únicas exige um pacote de software adequado para aquisição automática de dados de alto rendimento. Vários pacotes automáticos de software de aquisição de dados foram desenvolvidos para imagens automáticas para crio-EM de uma única partícula nos últimos oito anos. Este artigo apresenta a aplicação de um pipeline de aquisição de imagens totalmente automatizado para biomoléculas vitrificadas em condições de baixa dose.
Ele demonstra um pacote de software, que pode coletar dados crio-EM de forma completa, automática e precisa. Além disso, vários parâmetros microscópicos são facilmente controlados por este pacote de software. Este protocolo demonstra o potencial deste pacote de software em imagens automatizadas da proteína de pico da síndrome respiratória aguda grave-coronavírus 2 (SARS-CoV-2) com um microscópio crio-elétron de 200 keV equipado com um detector de elétrons direto (DED). Cerca de 3.000 imagens de filmes crio-EM foram adquiridas em uma única sessão (48 h) de coleta de dados, produzindo uma estrutura de resolução atômica da proteína de pico do SARS-CoV-2. Além disso, este estudo estrutural indica que a proteína do pico adota duas principais conformações, 1-RBD (domínio de ligação receptora) abertas e todas as conformidades fechadas de RBD.
Introduction
Crio-EM de partículas únicas tornou-se uma técnica de biologia estrutural convencional para determinação de estrutura de alta resolução de macromoléculas biológicas1. A reconstrução de partículas únicas depende da aquisição de um grande número de micrografos de amostras vitrificadas para extrair imagens de partículas bidimensionais (2D), que são então usadas para reconstruir uma estrutura tridimensional (3D) de uma macromolécula biológica2,3. Antes do desenvolvimento dos DEDs, a resolução obtida a partir da reconstrução de partículas únicas variou entre 4 e 30 Å4,5. Recentemente, a resolução alcançável do crio-EM de partículas únicas ultrapassou 1,8 Å6. O DED e o software automatizado de aquisição de dados têm sido os principais contribuintes para esta revolução de resolução7, onde a intervenção humana para a coleta de dados é mínima. Geralmente, a imagem crio-EM é realizada a baixas taxas de dose de elétrons (20-100 e/Å2) para minimizar os danos causados pela radiação induzida pelo feixe de elétrons de amostras biológicas, o que contribui para a baixa relação sinal-ruído (SNR) na imagem. Este baixo SNR impede a caracterização das estruturas de alta resolução das macromoléculas biológicas utilizando análise de partículas únicas.
Os detectores de elétrons de nova geração são detectores baseados em CMOS (complementar metal-óxido-semicondutor), que podem superar esses obstáculos relacionados ao SNR baixos. Essas câmeras CMOS de detecção direta permitem leitura rápida do sinal, devido à qual a câmera contribui com melhor função de spread de ponto, SNR adequado e excelente eficiência quântica de detetive (DQE) para macromoléculas biológicas. As câmeras de detecção direta oferecem alto SNR8 e baixo ruído nas imagens gravadas, resultando em um aumento quantitativo na eficiência quântica detetive (DQE)-uma medida de quanto ruído um detector adiciona a uma imagem. Essas câmeras também gravam filmes à velocidade de centenas de quadros por segundo, o que permite a aquisição rápida de dados9,10. Todas essas características tornam as câmeras de detecção direta rápida adequadas para aplicações de baixa dose.
As imagens de pilha corrigidas por movimento são usadas para o processamento de dados para calcular a classificação 2D e reconstruir um mapa de densidade 3D de macromoléculas usando vários pacotes de software como RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 e EMAN215. No entanto, para análise de partículas únicas, é necessário um enorme conjunto de dados para alcançar uma estrutura de alta resolução. Portanto, pedágios automáticos de aquisição de dados são altamente essenciais para a coleta de dados. Para registrar grandes conjuntos de dados crio-EM, vários pacotes de software foram usados na última década. Pacotes de software dedicados, como AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS e EPU, foram desenvolvidos para aquisição automatizada de dados.
Esses pacotes de software usam tarefas rotineiras para encontrar posições de furos automaticamente, correlacionando as imagens de baixa ampliação a imagens de alta ampliação, que auxilia na identificação de buracos com gelo vítreo de espessura de gelo apropriado para aquisição de imagens em condições de baixa dose. Esses pacotes de software reduziram o número de tarefas repetitivas e aumentaram o throughput da coleta de dados crio-EM, adquirindo uma vasta quantidade de dados de boa qualidade por vários dias continuamente, sem qualquer interrupção e a presença física do operador. Latitude-S é um pacote de software similar, que é usado para aquisição automática de dados para análise de partículas únicas. No entanto, este pacote de software só é adequado para DEDs K2/K3 e é fornecido com estes detectores.
Este protocolo demonstra o potencial do Latitude-S na aquisição automatizada de imagem da proteína de pico SARS-CoV-2 com um detector de elétrons direto equipado com um crio-EM de 200 keV (ver a Tabela de Materiais). Usando esta ferramenta de coleta de dados, 3.000 arquivos de filme de proteína de pico SARS-CoV-2 são automaticamente adquiridos, e mais processamento de dados é realizado para obter uma estrutura de proteína de pico de resolução 3.9-4.4 Å.
Protocol
Representative Results
Discussion
Latitude-S é uma interface de usuário intuitiva, que fornece um ambiente para configurar e coletar automaticamente milhares de micrografias de alta resolução ou arquivos de filme em dois dias. Fornece fácil navegação através das grades e mantém a posição do estágio do microscópio enquanto se move de baixa ampliação para alta ampliação. Cada etapa de aquisição de dados com o Latitude-S é eficiente em termos de tempo, com recursos como uma interface de usuário simples, streaming rápido de dados a até…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos o Departamento de Biotecnologia, Departamento de Ciência e Tecnologia (DST) e Ciência, e o Ministério do Desenvolvimento de Recursos Humanos (MHRD), Índia, para financiamento e a instalação crio-EM no IISc-Bangalore. Reconhecemos o Programa DBT-BUILDER (BT/INF/22/SP22844/2017) e o DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) para a instalação Nacional Cryo-EM no IISc, Bangalore. Reconhecemos o apoio financeiro do Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 e SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Agradecemos à Sra. Ishika Pramanick por preparar grades crio-EM, coleta de dados crio-EM e preparar a Tabela de Materiais. Agradecemos também ao Sr. Suman Mishra pelo processamento de imagens crio-EM e por nos ajudar a preparar os números. Agradecemos ao Prof. Raghavan Varadarajan por nos ajudar a obter a amostra purificada de proteína de pico para este estudo.
Materials
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
References
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