이 프로토콜은 NO-산화환원 생물학을 연구하기 위해 테트라하이드로바이오프테린(BH4)- 및 유도성 일차 뮤린 대식세포-결핍 일차 뮤린 대식세포를 배양하기 위해 확립되었다. 이 연구는 실험 결과와 결과의 해석을 혼동 할 수있는 전통적인 격리 및 배양 방법에서 발견되는 BH4 및 기타 유물의 잠재적 오염을 줄이는 데 중점을 둡니다.
대식세포는 몸 전체의 조혈 전구 세포로부터 유래되고, 염증 과정의 중심이며, 선천적 및 적응성 면역 반응에 참여한다. 대식세포의 시험관내 연구는 복막으로부터의 생체외 배양에 의해 또는 골수 유래 대식세포(BMDMs)를 형성하기 위해 골수성 골수 전구 세포의 분화를 통해 수행될 수 있다. 전구체로부터의 대식세포 분화에 대한 일반적인 접근법은 L929 세포 (LCM)로부터의 컨디셔닝 배지의 사용을 포함한다. 이 매체는 자체 생산하기 쉽지만 배치 변동성이 있으며 그 구성 요소는 정의되지 않았습니다. 유사하게, 태아 소 혈청 (FBS)은 성장을 지원하는 데 사용되지만 배치마다 다를 수있는 정의되지 않은 분자의 광대 한 혼합물을 포함합니다. 이러한 방법은 산화질소 생물학 및 산화환원 메커니즘의 연구에 적합하지 않은데, 둘 다 산화질소 신타제(iNOS)로부터 NO를 생산하는 데 필요한 산화질소 메커니즘 또는 보조인자인 테트라하이드로바이오프테린(BH4)과 같은 보조인자의 보충 수준을 방해하는 상당한 양의 소분자를 포함하고 있기 때문이다. 이 보고서에서, 우리는 세포 성장 및 분화에 적합한 조건을 유지하면서 외인성 바이오프테린의 수준을 감소시킴으로써 NO-산화환원 환경의 조절을 허용하는 최적화된 프로토콜을 제시한다. 배양 배지 구성을 엄격하게 제어하면 실험적 재현성을 보장하고 결과의 정확한 해석을 용이하게 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, BMDMs는 GTP 사이클로가수분해효소 (GCH)-결핍 마우스 모델로부터 수득되었다. BMDMs의 배양은 (i) 컨디셔닝 LCM, 또는 (ii) 재조합 M-CSF 및 GM-CSF를 함유하는 배지로 수행되어 BH4 및 NO-결핍 배양 조건을 수득하면서 최소한의 아티팩트를 생산한다 – 따라서 시험관내에서 NO-레독스 생물학 및 면역대사의 재현가능한 연구를 허용한다.
대식세포는 다양한 질병 및 조건에서 흥미로운 세포 유형으로 확립되어 왔으며, 많은 사람들이 선천적 면역에 대한 전통적인 초점과 관련이없는 것으로 보입니다. 대식세포 생리학은 그들이 거주하는 조직 또는 환경에 크게 의존하기 때문에, 그들의 기능과 관련된 다양한 경로를 연구하기 위해 많은 방법과 모델이 생겨났다. 역사적으로, RAW264.7과 같은 대식세포 세포주가 이 분야를 지배했지만, 이들은 다양한 일차 세포 모델에 유리하게 점진적으로 대체되어 왔다. 예를 들어, 뮤린 대식세포는 티오글리콜레이트로 처리한 후 복막 세척으로부터 단리될 수 있다. 조직-상주 세포의 연구에 유용한 모델을 제공하면서, 이들 복막 대식세포는 다양한 외부 자극에 대한 보다 하위된 반응을 입증하는 것으로 나타났으며, 이로써 많은 하류 응용에 대한 그들의 적합성을 제한한다1.
대안으로, 골수의 골수성 전구 세포로부터 유래 된 골수 유래 대식 세포 (BMDMs)는 성숙 및 대식세포와 관련된 다양한 고전적 표현형, M0 (순진한, 비 활성화), M1 (염증성, 일반적으로 LPS / IFN으로 활성화) 및 M2 (pro-resolution, 보통 IL-4로 활성화)2를 포함한 대식세포 생물학의 다양한 측면을 연구하기위한 귀중한 모델로 부상했다. 3. 그러나, 골수성 전구 세포를 BMDMs로 분화시키는 것은 배양 배지 4,5 내의 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF)의 존재에 의존한다. 이는 정제된 단백질을 배지에 첨가하거나 L929 컨디셔닝 배지(LCM)로부터 공급할 수 있다. BMDM 사용의 이점 (비용 및 효율성)은 다양한 자극 (사이토 카인, 대사 중간체 및 RNS / ROS)에 대한 민감성에 의해 제시된 한계와 비교되어야합니다.
이전의 데이터는 LCM의 내용이 잘못 정의되고 본질적으로 가변적이어서 다양한 하류 응용, 특히 NO 또는 산화 환원 생물학과 관련된 용도에 대해 신뢰할 수 없고 부적합하다는 것을 나타내며, 이는 외인성 화합물6의 존재에 의해 크게 영향을 받을 수 있기 때문이다. 이와 같이, 이러한 상세한 프로토콜은 잘 정의된 DMEM: 낮은 배치에서 배치 변동을 갖는 F12 배지의 사용과 재조합 뮤린 M-CSF 및 GM-CSF(과립구-대식세포 콜로니-자극 인자)의 첨가를 요구한다. 더욱이, 조직 배양 배지에서 보충물로서 전형적으로 사용되는 태아 소 혈청은 잘못 정의된 화합물 및 내재된 가변성의 또 다른 공급원을 제공한다. 따라서, BMDM의 신뢰할 수 있는 배양을 보장하기 위해 이러한 첨가제의 사용을 제어하고 최적화하는 것이 필요하다. FBS의 정의된 저내독소 공급원을 사용하고 단일 배치가 대량 구매되도록 보장함으로써 배양 조건이 안정적으로 정의되고 재현성이 보장됩니다. 본원에 기재된 프로토콜은 유세포 분석기6에 의해 대식세포 표면 마커 CD45 및 CD11b에 대해 평가될 때 95% 순도 이상의 대식세포 배양물을 생성하는 것으로 입증되었다.
이 BH4- 및 NO-결핍 BMDMs 배양 프로토콜은 테트라하이드로바이오프테린(BH4) 및 기타 간섭 아티팩트의 환원을 통해 일차 대식세포에서 NO-산화환원 생물학을 조사하기 위해 설계되었으며, 이러한 실험 모델로부터 얻은 결과의 신뢰성 및 재현성을 향상시키는 것을 목표로 한다.
중요한 단계에는 올바른 플라스틱 제품을 사용하는 것이 포함됩니다. 대식세포 전구세포는 부착성 세포이며 매우 끈적적거리고; 따라서 비조직 배양 (TC) 처리 플레이트의 사용은 다른 전구 세포로부터 그들을 선택하고 분리하는 데 결정적이며, 그렇지 않으면 부착하고 순도를 감소시킬 수 있습니다. 수확 당일에, 플레이트에서 대식세포를 분리하는 것은 얼음처럼 차가운 PBS를 필요로 하지만, EDTA 또는 심지어 세포를 매우 부드럽게 긁어내는 것은 다운스트림 적용(예를 들어, 용해 대 살아있는 세포 실험)에 따라 수행될 수 있다. 오염과 관련하여 특별한주의를 기울여야합니다. 골수를 내뿜는 동안 남은 모피와 피부의 박테리아 또는 바이러스 입자와의 잠재적 인 교차 오염이 발생할 수 있습니다. 그런 다음 가능한 한 조심하고 멸균하는 것이 필수적입니다. 따라서 해부 된 다리를 70 % 에탄올에 몇 분 동안 떨어 뜨리는 것이 좋습니다. 마찬가지로, 대식세포를 성장시키면서 항생제를 사용하는 것이 좋습니다.
이 프로토콜의 또 다른 한계는 Day 0에서의 셀 도금 밀도로부터 발생한다. 플러시 된 골수는 다양한 세포를 함유하고 있으며, 이는 잘못 계산되어 대식세포 전구 인자로 포함될 수 있으므로 잘못된 총 세포 수를 유발합니다. 후속 및 잠재적 변동성을 피하기 위해, 단리된 대식세포는 제7일에 따뜻한 PBS를 사용하여 부드럽게 플러싱될 수 있고, 부착을 허용하도록 자극 전에 적어도 1시간 전에 2%FBS DMEM:F12에서 정확한 밀도로 재플레이팅될 수 있다.
마지막으로, 성장한 대식세포의 배지를 사용하는 Griess 분석법에 의해 아질산염 수준을 확인하는 것은 데이터를 분석하는 데 필수적입니다. 더하기 측면에서,이 분석은 빠르고 저렴하게 수행 할 수 있습니다.
본원에 입증된 바와 같이, 이러한 맞춤형 프로토콜은 L-세포 컨디셔닝 배지(LCM)를 사용하여 대식세포를 단리하고 육성하는데 사용되는 보다 일반적인 프로토콜에 대한 보다 정의되고 개선된 대안이다. 실제로, NO-산화 환원 생물학을 연구 할 때 LCM을 사용하는 주요 관심사 중 하나는 상당한 양의 바이오 프테린이 검출되어 잠재적 인 대사 변화10을 유도한다는 것입니다. 예를 들어, 외인성 BH4는 결핍 된 모델을 신속하게 보충하고 iNOS의 보조 인자 역할을하여 원치 않는 산화 질소 생산을 유도 할 수 있습니다. LCM을 사용하는 또 다른 단점은 LCM이 L-929 세포에 의해 직접 분비되는 콜로니 자극 인자, 사이토카인 및 기타 부산물의 혼합물이며, 이는 모두 대식세포 생리학에 영향을 미칠 수있다6. 대식세포 증식 및 생존에 필수적인 M-CSF에서의 큰 공급에도 불구하고, 배치에서 배치로의 각 성분의 변화는 실험 전반에 걸쳐 변동성의 위험을 증가시킨다.
두 가지 문제를 해결하기 위해, 이 새로운 프로토콜은 정제된 M-CSF 및 GM-CSF의 조절된 양이 첨가되는 낮은 수준의 바이오프테린을 함유하는 잘 정의된 DMEM: F12 배지를 사용한다. 두 사이토카인 모두 대식세포의 분화와 성장을 돕는다. M-CSF는 특히 조혈모세포의 대식세포11로의 분화를 보장함으로써 골수 전구 세포로부터 BMDMs의 생성을 유도한다. 또한, GM-CSF는 자극 전에 첨가될 때 염증성 사이토카인 및 NO 생산을 증가시키는 것으로 나타났으며, 이는 NO-레독스 생물학12,13을 연구할 때 실질적인 이점이다.
이 새로운 방법이 다루는 또 다른 주요 요인은 FBS의 것으로, 일반적으로 세포의 건강과 성장에 필수적인 영양소의 원천으로 사용됩니다. LCM과 유사하게, FBS는 상당한 수준의 바이오프테린을 함유하고 있다. 자극 전에 세포의 완전한 혈청 기아가 처음에 OptiMEM + 0.2% BSA를 사용하여 고려되었지만, 대식세포는 분리의 징후를 보였으며, 이는 Bailey et al.6에 의해 기술된 바와 같이 감소된 세포 생존율을 나타낸다. 그러나, 대식세포가 혈청에 대한 절대적인 요구조건을 입증함에 따라, 바이오웨스트로부터의 초저 내독소 FBS가 선택되었다. 배치는 바이오프테린에 대해 테스트되고 대량 구매 전에 사전 선택되어 신뢰할 수 있고 잘 정의 된 공급을 보장했습니다. 바이오 프테린의 오염 소스를 줄이기위한 목적으로 더 나아가기 위해 FBS의 농도 감소가 테스트되었습니다. 세포 배양에 일반적으로 사용되는 10% 혈청을 사용하는 대신에, FBS 수준은 골수를 대식세포로 7-일 동안 5%로 유지하고, 마지막 날에 밤새 자극하는 동안 2%로 더 감소된다. 이것은 검출 된 바이오 프테린의 무시할 수있는 수준을 보장하지만 대식세포의 건강과 순응을위한 충분한 영양소를 보장합니다. 재조합 M-CSF를 이용한 이러한 새롭게 최적화된 프로토콜이 일차 대식세포의 배양 및 활성화를 위한 보다 제어된 환경을 초래하지만, 주된 한계는 이 방법이 LCM 방법을 사용하는 것보다 더 비싸다는 것이다.
이 모든 요소를 고려하여 두 가지 방법을 직접 비교했습니다. 중요하게도, 재조합 M-CSF 및 GM-CSF를 사용하여 본원에 제시된 새롭게 변형된 프로토콜은 배지가 BH4를 오염시키지 않는 보다 재현성 있는 시스템을 초래하였다. 이것의 효과는 두 가지였습니다. BH4 결핍 세포는 진정으로 BH4가 결여되었고, 이는 LPS로 M1 상태로 자극한 후 배지에서 검출가능한 아질산염 축적을 최소화하는 결과를 가져왔다. 이는 LCM에서 배양된 동일한 BMDM 세포와는 대조적이었으며, 여기서 유의한 BH4 및 아질산염이 검출되었다.
결론적으로,이 방법의 강점은 대식세포에서 NO 및 산화 환원 신호전달에 영향을 줄 수있는 각 매개 변수를 철저히 평가하여 바이오 프테린 수준을 제어하려는 노력에 있습니다. 특히, 이는 NO-산화환원 생물학 분야에서 최대의 재현성과 표준화를 보장한다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 M.J..C. (FS / 14 / 56 / 31049), British Heart Foundation Programme 보조금 (RG / 17 / 10 / 32859 및 RG / 12 / 5 / 29576), Wellcome Trust (090532 / Z / 09 / Z) 및 NIH Research (NIHR) Oxford Biomedical Research Centre에 수여 된 British Heart Foundation Intermediate Fellowship의 지원을 받았습니다. 저자는 또한 옥스포드 BHF 연구 우수 센터 (RE / 13 / 1 / 30181 및 RE / 18 / 3 / 34214)의 지원을 인정하고 싶습니다.
1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | 1mL 6% LUER syringe |
10 mL plastic syringe | Fisher scientific | 14955453 | |
6 well plate sterile non-treated | CytoOne | CC7672-7506 | Flat bottom |
DMEM/F-12 (1:1) (1x) | Gibco, Life Technologies | 21331-020 | |
DMSO sterile | Sigma-aldrich | D2650-100ML | |
Easy flask 260 mL | Thermo Scientific | 156800 | |
L-Glutamine Solution 200 mM | Sigma-aldrich | G7513-100ML | |
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-aldrich | L4391-1MG | |
Mutlidish 12 sterile non-treated | Thermo Scientific | 150200 | Flat bottom |
Needle 25G, 0.5 x 16 mm | BD Microlance 3 | 300600 | |
PBS (pH7.4, 1x) | Gibco, Life Technologies | 10010-015 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-aldrich | P0781-100ML | |
petri dish 100 x15 mm sterile | Falcon, Corning incorporated | 351029 | |
Recombinant murine GM-CSF | PEPROTECH | 315-03 | |
Recombinant murine IFN-γ | PEPROTECH | 315-05 | |
Recombinant murine M-CSF | PEPROTECH | 315-02 | |
Scalpel n23 | Swann-Morton | 0510 | |
Ultra-low endotoxin FBS | Biowest | S1860-500 | |
VWR cell strainers 70 µm nylon | VWR | 732-2758 |