Test di assorbimento delle vescicole extracellulari tramite analisi di imaging al microscopio confocale
Summary
Le vescicole extracellulari (EV) contribuiscono alla biologia cellulare e alle comunicazioni intercellulari. C’è bisogno di saggi pratici per visualizzare e quantificare l’assorbimento dei veicoli elettrici da parte delle cellule. L’attuale protocollo propone il test di assorbimento EV utilizzando l’imaging tridimensionale a fluorescenza tramite microscopia confocale, dopo l’isolamento EV da un dispositivo microfluidico basato su nanofiltrazione.
Abstract
C’è bisogno di saggi pratici per visualizzare e quantificare l’assorbimento delle vescicole extracellulari (EV) delle cellule. L’assorbimento di veicoli elettrici svolge un ruolo nella comunicazione intercellulare in vari campi di ricerca; biologia del cancro, neuroscienze e somministrazione di farmaci. Molti saggi di assorbimento dei veicoli elettrici sono stati riportati in letteratura; tuttavia, vi è una mancanza di metodologia sperimentale pratica e dettagliata. L’assorbimento dei veicoli elettrici può essere valutato etichettando in modo fluorescente i veicoli elettrici per rilevare la loro posizione all’interno delle cellule. Distinguere tra EV internalizzati nelle celle e EV superficiali sulle cellule è difficile, ma fondamentale, per determinare con precisione l’assorbimento ev. Pertanto, in questo lavoro viene proposto un test che quantifica in modo efficiente l’assorbimento di EV attraverso la microscopia confocale a fluorescenza tridimensionale (3D). I veicoli elettrici con etichetta fluorescente sono stati preparati utilizzando un dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione, visualizzato mediante microscopia confocale 3D e quindi analizzato attraverso un software avanzato di elaborazione delle immagini. Il protocollo fornisce una solida metodologia per l’analisi dei veicoli elettrici a livello cellulare e un approccio pratico per un’analisi efficiente.
Introduction
Le vescicole extracellulari (EV) sono particelle legate alla membrana lipidica di dimensioni nanometriche che sono classificate in base alle loro dimensioni: ectosomi (100-500 nm) ed esosomi (50-150 nm)1. Gli EV contengono varie biomolecole, come proteine, acidi nucleici e lipidi. Queste biomolecole provengono dalle cellule prima di essere incapsulate come carico e rilasciate nello spazio extracellulare tramite EV1,2,3.
A causa della varietà del loro carico, si ritiene che i veicoli elettrici svolgano un ruolo attivo nella comunicazione intercellulare. Il rilascio e l’assorbimento di VEICOLI elettrici da parte delle cellule consentono il trasferimento di biomolecole tra le cellule4,5. L’introduzione di un carico EV in una cella può alterare le funzioni della cellula ricevente e lo stato omeostatico4,5,6. I veicoli elettrici sono interiorizzati attraverso più percorsi; tuttavia, i meccanismi esatti non sono stati dimostrati con precisione.
La maggior parte dei test di assorbimento dei veicoli elettrici, come l’etichettatura genetica, etichettano fluorescentemente i singoli veicoli elettrici7. Il segnale risultante può essere misurato mediante fotometro a micropiastre, citometria a flusso o microscopia, con ogni tecnologia che presenta limitazioni sostanziali. I fotometri a micropiastre, la citometria a flusso o la microscopia bidimensionale standard (2D) non possono distinguere tra EV internalizzati e attaccati superficialmente8,9. Inoltre, la necessaria preparazione del campione per ciascuna di queste tecniche può introdurre ulteriori problemi nella valutazione dell’assorbimento dei veicoli elettrici. Ad esempio, il sollevamento di cellule aderenti con tripsina prima dell’analisi dell’assorbimento di EV può scindere alcuni EV attaccati superficialmente sulla superficie della cellula10,11. La tripsina può anche interagire con la superficie cellulare, influenzando la cellula e il fenotipo EV. Inoltre, la tripsina non può staccare completamente i veicoli elettrici superficiali, distorcendo le popolazioni isolate.
Per etichettare accuratamente i veicoli elettrici con coloranti fluorescenti, sono necessarie ulteriori fasi di lavaggio per rimuovere il colorante residuo7. Le tecniche di isolamento accettate possono anche contribuire a segnali falsi positivi a causa della coagulazione che si verifica durante l’isolamento EV. Ad esempio, l’ultracentrifugazione seriale (UC) è ampiamente utilizzata per isolare i veicoli elettrici e rimuovere il colorante immobilizzato. Tuttavia, UC può co-precipitare i veicoli elettrici e il colorante residuo può portare a un segnale falso positivo12,13. Altri metodi di nanofiltrazione, come la filtrazione a colonna, sono anche ampiamente utilizzati per la rimozione del colorante non immobilizzato. La natura complessa dei veicoli elettrici e del colorante che interagiscono all’interno della matrice della colonna può portare alla rimozione incompleta del colorante residuo a causa del cut-off molecolare della colonna alterato dal complesso input14,15,16.
L’attuale protocollo propone un dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione per isolare e lavare i veicoli elettrici isolati etichettati fluorescentemente. Il dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione può fornire una filtrazione efficiente tramite la tecnologia di separazione assistita da fluido (FAST)17,18. FAST riduce la caduta di pressione attraverso il filtro, riducendo così la potenziale aggregazione tra veicoli elettrici e coloranti. Rimuovendo in modo efficiente il colorante residuo, è possibile migliorare la qualità dei veicoli elettrici etichettati fluorescentemente e la specificità del test.
La microscopia confocale è in grado di distinguere tra EV internalizzati e superficialmente attaccati sulla superficie cellulare e studiare in modo completo i meccanismi cellulari di assorbimento dei veicoli elettrici in una risoluzione spaziotemporale19,20,21,22,23,24,25. Ad esempio, Sung et al. hanno descritto la visualizzazione del ciclo di vita dell’esosoma utilizzando il loro reporter di cellule vive sviluppato. La posizione dei veicoli elettrici internalizzati è stata rilevata e analizzata utilizzando un microscopio confocale in strumenti tridimensionali (3D) e di elaborazione post-immagine20. Sebbene la dimensione dei piccoli veicoli elettrici (40-200 nm) sia inferiore al limite di risoluzione del microscopio ottico, i veicoli elettrici marcati fluorescentemente possono essere rilevati al microscopio confocale poiché il fotorivelatore può rilevare l’emissione di fluorescenza potenziata. Pertanto, la localizzazione subcellulare dei veicoli elettrici marcati fluorescentemente all’interno di una cellula può essere determinata con precisione acquisendo più immagini impilate z dei veicoli elettrici e degli organelli cellulari circostanti.
Inoltre, la ricostruzione 3D e l’elaborazione post-dati possono fornire ulteriori informazioni sul posizionamento dei veicoli elettrici internalizzati, superficiali e fluttuanti. Utilizzando questi processi in combinazione con l’imaging delle cellule vive time-lapse offerto dalla microscopia confocale, il livello di assorbimento dei veicoli elettrici può essere valutato con precisione ed è anche possibile il monitoraggio in tempo reale dell’assorbimento dei veicoli elettrici. Inoltre, l’analisi del traffico di veicoli elettrici può essere eseguita utilizzando la microscopia confocale valutando la co-localizzazione dei veicoli elettrici con gli organelli, un primo passo per determinare come i veicoli elettrici internalizzati sono coinvolti nella funzione intracellulare. Questo protocollo descrive la metodologia per l’esecuzione di un test di assorbimento di EV utilizzando il dispositivo microfluidico basato su nanofiltrazione17,26, la microscopia confocale e l’analisi post-immagine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un test di assorbimento EV basato sull’imaging a fluorescenza 3D tramite microscopia confocale fornisce una metodologia efficiente e un’analisi sensibile. Questa etichettatura fluorescente dei veicoli elettrici facilita la visualizzazione dei veicoli elettrici ed esegue con successo un preciso test di assorbimento dei veicoli elettrici. I metodi precedenti per l’etichettatura dei veicoli elettrici e la rimozione del colorante residuo sono stati segnalati rimuovendo la precipitazione utilizzando l’ultracentrifuga…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da n. di sovvenzione NCI. U54CA143803, CA163124, CA093900 e CA143055 a K. J. P. Questa ricerca è stata supportata da una sovvenzione del Korea Health Technology R&D Project attraverso il Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziato dal Ministero della Salute e del Welfare, Repubblica di Corea (numero di sovvenzione: HI19C1122). Opera di J. Kim e Y.-K. Cho è stato sostenuto dall’Institute for Basic Science (IBS-R020-D1), finanziato dal governo coreano. Gli autori ringraziano i membri attuali e passati del Brady Urological Institute, in particolare i membri del laboratorio Pienta-Amend, per la lettura critica del manoscritto.
Materials
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain – 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
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